Kaksoisisotooppimenetelmän validointi ileaalisen proteiinin sulavuuden mittaamiseksi (VALDIM)

Testiateria koostuu 60 g:sta lyofilisoitua kokomunajauhetta, joka sisältää 30 g 2H-munaproteiinia ja 800 mg [U-13C]-spirulinaa tai 400 mg:sta 13C-vapaata AA-seosta, sekoitettuna veteen ja kypsennetty munakkaana. 2H-munajauheen ovat tuottaneet yhteistyökumppanimme St John's Research Institutesta Bangaloressa (Intia). Celite (happoon liukenematon tuhka, Advanced Minerals Corporation) lisätään ateriaan sulamattomana merkkiaineena, jolla tarkistetaan aterian talteenotto jätevesissä. Koe-ateria annetaan boluksena tai tasanteella (toistuvat miniateriat) kohderyhmistä riippuen. 600 g 2H-leimattuja lyofilisoituja munia saadaan kerroskanoista, joille annetaan tasaisesti 2H-leimattua AA-seosta suun kautta 60 päivän ajan päivittäisen ruokinnan kanssa. Mikrobiologisia analyysejä tehdään niiden turvallisuuden varmistamiseksi ihmisravinnoksi.

Tutkimuksen lopussa otetaan mukaan 18 vapaaehtoista, jotka testataan Avicenne Hospitalin (Ranska) Human Nutrition Research Centerissä. Pääkriteerit ovat miehet ja naiset, 18-45-vuotiaat, painoindeksi (BMI) 18-30 kg/m2. Tärkeimmät poissulkemiskriteerit ovat mikä tahansa ruoansulatuskanavan tai maksan patologia, allergia munalle, allergia lateksia vastaan, raskaana olevat naiset. Invasiivisen intubaatiomenettelyn vuoksi tutkijat aikovat värvätä 30 vapaaehtoista mukautumaan tavanomaiseen 40 %:n keskeyttämiseen.

Aiheet jaetaan kolmeen ryhmään, joissa n = 6:

• Bolus-spi, n = 6, vapaaehtoiset nauttivat testiaterian boluksena kerralla t = 0, 13C-spirulina vertailuproteiinina
• Plateau-spi, n = 6, vapaaehtoiset nauttivat koe-aterian tasangolla ruokintaprotokollassa, jossa 13C-spirulina on vertailuproteiini
• Plateau-AA, n = 6, vapaaehtoiset nauttivat testiaterian tasangolla ruokintaprotokollan mukaisesti, ja 13C-vapaa AA-seos on referenssi "proteiini"

Viikkoa ennen koetta vapaaehtoiset noudattavat normaalia ruokavaliota, joka on mukautettu heidän ruumiinpainoinsa proteiininsaannin hallitsemiseksi (1,3 g proteiinia/kg ruumiinpainoa).

Vapaaehtoiset saapuvat Avicenne sairaalan ravitsemuskeskukseen koepäivää edeltävänä aamuna. Ne varustetaan kolminkertaisella onteloputkella, jonka annetaan kulkea suolistossa 24 tunnin ajan. Yksi onteloista on läpikuultamaton, ja se toimii perfusoimaan imeytymätöntä valmistajaa suolistossa (hidas merkkimenetelmä). Toinen ontelo on tarkoitettu painotetun ilmapallon täyttämiseen, mikä helpottaa putken liikkumista. Kolmas ontelo on omistettu jatkuvaan jätevesien imemiseen 15 cm perfuusiokohdan alapuolella. Jätevesien imeytymättömän merkkiaineen mittaus mahdollistaa jäteveden virtausnopeuden määrittämisen.

Koepäivänä putken asento tarkistetaan radiografialla sen sijainnin varmistamiseksi sykkyräsuolen päässä. Katetri asetetaan kyynärvarren laskimoon verinäytteitä varten. Imeytymättömän markkerin, polyetyleeniglykoli (PEG) 4000 (20 g/l), perfuusio alkaa virtausnopeudella 1 ml/min. Suolen virtaus ja sykkyräsuolen tyvinäyte kerätään 30 minuutin ajan. Perusplasma- ja virtsanäyte kerätään.

Kun t = 0, ryhmän "Bolus-spi" vapaaehtoiset syövät kaiken koe-aterian alle 20 minuutissa. Ryhmien "Plateau-spi" ja "Plateau-AA" vapaaehtoisille koe-ateria jaetaan 22 yhtä suureen annokseen ja he nauttivat ensimmäisen aterian 6 miniannoksen alkuannoksena. Sitten he syövät yksittäisiä miniannoksia 30 minuutin välein 7,5 tunnin ajan. Yksi annos on omistettu ateria-analyyseille. Kunnes t = 8, suolen sisältöä kerätään jatkuvasti imemällä ja yhdistetään 30 minuutin välein. Verinäytteet otetaan tunnin välein 4 tunnin ajan ja 30 minuutin välein t = 5 - t = 8. Virtsa kerätään 2 tunnin välein, kunnes t = 8 (virtsan kokonaismäärä kirjataan jokaisella aikapisteellä suhteellista yhdistämistä varten). Hengitysnäytteet otetaan 30 minuutin välein. Hiilidioksidin tuotto (VCO2) arvioidaan tunneittain 10 minuutin ajan epäsuoralla kalorimetrialla (Canopy). Virtsanäyte kerätään kokeen alussa ja tutkimusprotokollan aikana. Ulostenäytteet kerätään ennen kokeen alkua ja seuraavan 24 tunnin aikana. Nenä-ileaalinen letku poistetaan viimeisen effluentin keräämisen jälkeen t = 8. Nenä-ileaaliputki poistetaan viimeisen effluentin keräämisen jälkeen t = 8.

Seuraavat analyysit suoritetaan:

• PEG-4000:n konsentraatio turbidimetrisellä menetelmällä digestionäytteissä
• Kokonaisvetypitoisuus ja 2H-rikastus aterioissa ja digestionäytteissä isotooppisuhdemassaspektrometrialla (IRMS) kytkettynä pyrolyysianalysaattoriin
• Kokonaishiilipitoisuus ja 13C-rikastus aterioissa ja digestionäytteissä alkuaineanalysaattorilla (EA), joka on kytketty IRMS:ään
• AA-pitoisuus aterioissa ja digestionäytteissä Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) -menetelmällä
• 13C-AA- ja 2H-AA-rikastusplasma- ja aterianäytteet nestekromatografialla yhdistettynä tandem-massaspektrometriaan (LC-MS/MS)
• 13C-AA- ja 2H-AA-rikastus ruoansulatus- ja aterianäytteissä kaasukromatografia-poltto-isotooppisuhdemassaspektrometrialla (GC-C-IRMS)
• Seliittipitoisuus yhdistetyissä (0-8 h) digestionäytteissä
• Multiflow-IRMS:n 13CO2 hengitysnäytteessä
• Digesti-, plasma-, virtsa- ja ulostenäytteiden aminohappo ja peptidomi

Osa analyyseistä (13C-AA- ja 2H-AA-rikastusplasma ja ateria LC-MS/MS:llä, -omic-analyysit) tekevät yhteistyökumppanimme St John's Research Institutesta Bangaloressa (Intia).