IPAの診断のための呼気サンプル中のVOC

背景 侵襲性肺アスペルギルス症 (IPA) の診断は、免疫抑制患者の予後および治療計画に重大な影響を及ぼします。 アスペルギルス属菌が環境中に遍在していること、ひいては健康な被験者の呼吸器系にそのような分離株が遍在していることは、診断上大きな課題となっています。 すなわち、IPA と気道の非侵襲的定着とを区別することは困難である可能性がある。 悪性腫瘍や腫瘍治療、造血幹細胞や固形臓器移植、免疫調節薬などの免疫抑制患者の罹患率の大幅な増加が、このジレンマをさらに悪化させています(1)。 特に、急性骨髄性白血病 (AML) 患者は IPA を発症するリスクが高く、そのような患者の 5 ～ 15% が AML 診断後の最初の 3 か月間で IPA を発症します。(1-3) AML患者の最大5%が受診時にIPAを有する可能性があるため、新たにAMLと診断されてランバン医療センター（RMC）に入院した患者は、診断時にIPAの存在をスクリーニングする胸部コンピューター断層撮影（CT）を受けることが定期的に行われている。後で IPA が疑われる場合にさらに参照するためのベースラインとなります。(3) AML患者におけるIPAの可能性がある、または証明されていると診断するには、微生物学的証拠とともに示唆的な画像所見が必要です。 場合によっては、末梢血中のバイオマーカー (主に d-ガラクトマンナン抗原やアスペルギルス属のポリメラーゼ連鎖反応) を使用して診断を行うことができますが、これらのアッセイの感度は低く、多くの場合、この低侵襲アプローチでは十分な診断の確実性が得られません。 このような場合には、通常、気管支肺胞洗浄を伴う気管支鏡検査が行われます。 この侵襲的処置は、IPA が疑われる患者にとって特に危険であり、患者の大多数は基礎疾患のために非常に虚弱です (4)。 これらの考慮事項により、IPA の診断における追加の非侵襲的治療法が模索されてきました。 (5) そのようなアプローチの 1 つは、呼気サンプル中の揮発性有機化合物 (VOC) 分析です。 室温での低い蒸気圧を特徴とする呼気の VOC プロファイル分析は、新生物 (6)、感染症 (7)、炎症過程などのさまざまな病気の非侵襲的スクリーニングと診断の可能性を備えた新興の診断分野です。 (8) これまでの研究では、代謝活性のあるアスペルギルス属の潜在的な VOC マーカーが同定されており (9)、ヒトを対象とした小規模な前向き研究 (10) では、VOC ベースの IPA 同定に対する有望な診断性能が示されています。 しかし、これらの試みはいくつかの落とし穴によって妨げられてきました。 第一に、インビトロでのアスペルギルス属菌の VOC プロファイルは、定着した患者の呼気分析で見つかった VOC とはほとんど関係がないようです (5)。 第二に、呼気中の VOC は個人間で大きく異なる傾向があり、一時的な制御がないこと (つまり、IPA 開発の前後で同じ個人における VOC プロファイルの変化) が重要な注意点となります (10)。 第三に、私たちの知る限り、IPA 処理に対する VOC プロファイルの反応を評価した縦断研究はありません。

この前向き縦断研究では、RMC で治療される血液患者の 2 つの重要な特徴を利用して、これらのハードルを克服することを目指しています。 まず、新たにAMLと診断された患者はIPAの有病率が比較的高い。 第二に、AML の診断時にすべての患者に胸部 CT が実行されます。 したがって、ベースライン CT が正常な患者から呼気サンプルを収集することは、陰性対照として機能し、同じ患者における IPA 発症前後の VOC プロファイルの比較を可能にします。 患者が IPA から回復した後にさらにサンプリングを行うと、長期的な管理がさらに強化されます。

目標 呼気サンプル中の IPA を予測する VOC プロファイルの同定

方法

研究デザイン:

これは単一施設の非無作為化前向きコホート研究です。 同意した患者からの呼気サンプルは、IPA の最初の CT スクリーニング時に VOC プロファイルについて分析されます。 さらに、サンプルは、可能性のある、可能性の高い、または確認された IPA (以下に詳述する EORTC 基準 (4) に従って定義される) の診断時にも収集されます。

設定と参加者:

新たにAMLと診断され、RMC血液内科で治療を開始する患者にアプローチする。 対象期間は2022年10月1日から2025年3月31日までとなります。

包含基準:

急性骨髄性白血病の新規診断、および/または計画された造血幹細胞移植（HCT） 採取から30日以内に実施される胸部CT 18歳以上 合計10Lの呼気サンプルをテドラーバッグに直接提供できる機能

除外基準:

インフォームド・コンセントを提供する患者の能力を損なう状態

サンプルコレクション:

呼気サンプルは、血液内科の 23 室の専用入院室の 1 室で収集されます。この部屋は陽圧で、E-pure 高効率微粒子空気 (HEPA) フィルター (ADS-Laminaire、イスラエル) で環境制御されています。 患者はサンプル採取前の 6 時間は歯磨き、歯の洗浄、飲食、喫煙を控える必要があります。 10 分間座った後 (運動によるイソプレン濃度の上昇を避けるため (11) )、患者はテドラーバッグ (SKC、韓国) に 10L の呼気を満たすよう求められます。 同時に、同一のテドラーバッグを周囲空気で満たすものとする。

サンプルを収集するたびに、次のデータが記録されます。

患者の特徴（年齢、血液腫瘍学的診断、最初の診断からの時間、現在の治療、該当する場合は HCT からの時間、背景診断を含む） 現在の薬物療法（前月に処方されたすべての抗生物質および抗真菌薬を含む）。

過去 1 か月間に実施されたすべての培養物、血清学的アッセイ、核酸増幅研究、全血球計算および化学検査、ボリコナゾール血漿レベルおよび胸部画像検査を含む現在の診断検査。

サンプルの処理と VOC 抽出:

すべてのテドラーバッグは収集後 4℃ で保管されます。 2 つの平行な加熱脱着チューブへの吸着は、Gilian LFS-113 低流量パーソナル空気サンプリング ポンプ (SRA 計測器、イタリア、ミラノ) を介して実行され、サンプリングから 72 時間以内に実行され、周囲条件下で保管されます。 これらのサンプルはラベル付け（コード化）され、環境化学研究所（イスラエル、エルサレムのヘブライ大学、カサリ化学研究所）に送られます。

分析:

熱脱離は、分析グレード (99.999%) のヘリウムガスをキャリアとして使用し、290 で 20 分間行われます。 タンデムガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) への注入は、流量 40 mL/min を超えない同様の入口温度で実行されます。 初期 GC 温度プログラムは、以前に報告された (10) のプロトコルを模倣します。40 ℃で 3 分間、1 分あたり 5 ℃の速度で 70 ℃まで上昇し、3 分間保持し、7 ℃ で 203 ℃まで上昇します。毎分上昇させて4分間保持し、270℃まで急速に上昇させて5分間保持します。 トリプル四重極質量分析計 (Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ) をタンデムに接続し、質量測定範囲は 20 ～ 400 m/z とします。

侵襲性肺アスペルギルス症の診断は、最新の EORTC 基準 (4) に従って以下のいずれかとして定義されます。

確認済みIPAは、アスペルギルス属菌の培養陽性、または菌糸による組織浸潤の組織病理学的証明を伴う呼吸器生検標本として定義されます。

「推定 IPA」は、(1) 胸部 CT 上の一致する X 線写真の特徴 (ハロー サイン、エアクレセント サイン、または空洞の有無にかかわらず、密で境界のはっきりした病変) および以下のいずれかとして定義されます。喀痰、気管支肺胞洗浄 (BAL) 液または気管支ブラシを含む任意の呼吸器検体からの細胞学、直接顕微鏡検査、または培養による菌株の検出 血漿、血清、または BAL 液から陽性 D-ガラクトマンナン抗原が検出 アスペルギルス属に対するポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) が陽性血漿、血清、または BAL 液で検出された種菌「IPA の可能性」、胸部 CT 上の適合する X 線写真の特徴として定義 (1) (ハロー サイン、エアクレセント サイン、空洞の有無にかかわらず、密で境界がはっきりした病変) ）裏付けとなる検査所見なし。

IPA 診断の確率に関する追加情報は、研究期間の終了時に完全な電子医療記録 (EMR) をレビューする 2 人の独立した観察者 (I.G. と A.S.) によって収集され、単一の確率スコア 1 ～ 10 (1 は非常に低い) が割り当てられます。疾患の全臨床経過を考慮すると、IPA の確率、10 はほぼ確実な IPA に相当します）。

追加の変数とデータソース: すべてのコホート患者について、MD クローン ソフトウェアの支援により取得された当院の電子医療記録 (EMR) システムから疫学情報と臨床情報が抽出されます。 一部のデータは暗号化されていないため、カルテに毎日の追跡調査で記録されたデータにアクセスするには、患者の個人情報を取得する必要があります。 すべてのデータは後でコード化され、名前、姓、生年月日、ID 番号、住所などの個人識別情報が削除されます。 すべてのデータは、主任研究者の手元で指定されたハードディスクに保存されます。 データ ソースには、「プロメテウス」EMR レジストリ上の患者のファイルと、MD クローン ソフトウェアを使用して取得したデータが含まれます。 収集されるデータには、人口統計（年齢、性別）、背景診断、滞在期間と他のユニットへの移送、検査結果、記録されたバイタルサイン、毎日の追跡調査で記録された酸素化方法が含まれます。

サンプル収集スケジュール: この研究に含まれる同意した患者の最初のサンプルは、ベースラインの胸部 CT から 7 日以内に収集されます。 その後、治療医師による IPA の臨床的疑い（常に胸部 CT の実行につながる疑い）の後、サンプルは胸部 CT から 7 日以内に収集されます。 追加のサンプルは、担当医師による抗真菌治療の中止から 7 日以内に収集されます。 サンプリング スケジュールを図 1 に示します。

図 1 - サンプリング戦略。 この研究の介入は、太字の赤で下線を引いたサンプリングに限定されています。他のすべての手順は AML 患者の通常の管理の一部であり、この研究への参加による影響はまったくありません。 AML - 急性骨髄性白血病。 Dx - 診断; CT - コンピューター断層撮影。 IPA - 侵襲性肺アスペルギルス症; Tx - 治療; d/c - 廃止されました。 GGO - すりガラスの不透明度。

データ処理と統計分析:

臨床データは、記述統計、パラメトリック検定およびノンパラメトリック検定を必要に応じて使用して分析するものとします。 すべての統計分析は、R ソフトウェア バージョン 4.0.0 (「植樹祭」) 以降を使用して実行されます。 患者のベースライン特性、検査結果および画像検査結果、以前の診断および治療記録を含むすべての識別可能なデータは、研究期間中、主任研究者によって指定された RAS 暗号化固相メモリデバイスに保存されるものとします。 患者の名前、ID番号、住所、生年月日は保存されません。

質量分析の出力は、MassHunter ワークステーションとソフトウェア (Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ) を使用して検査されます。 部分最小二乗判別分析は、SIMCA ソフトウェア バージョン 14.0 以降 (MKS Umetrics、スウェーデン) を使用して実行されます。 各 m/z 範囲について、ロジスティック回帰モデルが構築され、投影の変数重要度 (VIP) の計算が可能になります。 すべての VIP ≥1 については、対応するイオン プロファイルが潜在的なターゲットとして選択されます。 これらは、付録 A にまとめられているように、IPA を示す以前に示唆された代謝物 (10,11) および既存のデータベースと比較されます。同じ m/z 値が、異なる物質として異なる代謝物に対応する可能性があるため、このような同定は非常に重要です。同じ生殖質電荷比を持つ可能性があります。 次に、特定されたすべての物質が、国立標準技術研究所 (NIST) 11 質量スペクトル ライブラリ (Scientific Instrument Services、ニュージャージー州リンゴーズ) および純粋な化学標準と照らし合わせて確認されます。 最後に、選択した特徴的な VOC で構成されるデジタル マトリックスが Python (バージョン 3.10.5 以降) にインポートされ、バイナリ ロジスティック回帰によって予測パフォーマンスが評価されたさまざまな分類モデルが構築されます。 呼気ＶＯＣ発現レベルと、血清およびＢＡＬ ｄ－ガラクトマンナンのレベルと、ＩＰＡの診断確実性（以下に定義するように、確認済み、可能性が高い、または可能である）との間の相関関係は、パーソンのｒを使用して達成される。

サンプルサイズと検出力:

この前向き縦断研究では、IPAを発症する可能性が高い患者（すなわち、急性白血病と診断された患者）が診断時に登録される。 当センターではベースライン胸部CTスクリーニングを実施して潜在的なIPAをベースラインで特定するため、通常のX線撮影後に収集されたVOCは十分な対照として機能します。 このような患者の少なくとも 15% は、その後数か月間で IPA を発症し続けるため (3)、募集時に必要なサンプルサイズが制限されます。 以前に報告された追跡調査の順守に基づいて (12)、脱落率が低くなり、これまでとらえどころのなかった VOC プロファイルの治療後の変化を検出できるようになると予想されます。

これらの計算の目的で、以前に報告された VOC アッセイの感度 (呼吸器分泌物、BAL、または患者血清における微生物学または抗原検査と比較して) をそれぞれ 80 ～ 95% と仮定しました。(10) 最近の遡及調査では、IPA の発生率が最初のスクリーニング CT で 5%、最初の入院中にさらに 10% であることが特定されました (3)。 これは、許容された有意性 (アルファ = 0.05) と検出力 (ベータ = 0.8) の仮定の下で計算された、患者 124 人の推定サンプル サイズに変換されます。 推定登録率 70% とさらに 15% の除外率を考慮すると、合計推定サンプルサイズは 208 人の患者となります。 私たちの病院で治療される新規急性白血病症例の平均年間発生率 90 人と予測すると、このサンプリング目標は、事前に指定された 30 か月の募集期間内に容易に達成できるはずです。 したがって、参加者数は 300 名を予定しております。

倫理的考慮事項 IPA 識別のための非侵襲的技術の開発と改良は、20 年以上にわたってさまざまな専門家団体が掲げた目標でした。 (1,4) 患者が提案した診断ツールは、参加者にとって不都合が最小限またはまったくなく、この完全に非侵襲的な治療法では潜在的な副作用や危険性は無視できるものであると考えられます。

データ抽出後、すべてのデータから名前、姓、ID 番号、事件番号、生年月日、住所などの識別情報が削除されます。最初のデータ抽出が完了すると、すべて破棄されます。 データは、PI の手によって RAS 暗号化された指定された SD デバイスに安全に保存され、この研究がデータのプライバシーや対象患者の医療機密に影響を与える可能性を最小限に抑えるものとします。 この調査の結果が重症者の管理と予後に与える可能性のある直接的な影響を考慮すると、この研究の利点が潜在的なリスクを上回ることがわかります。

資金提供 これまでのところ、この研究には外部からの資金提供はありません。

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