COV en Muestras de Aliento para el Diagnóstico de API

ANTECEDENTES El diagnóstico de aspergilosis pulmonar invasiva (IPA) conlleva graves implicaciones para el pronóstico y el plan de tratamiento del paciente inmunodeprimido. La omnipresencia de Aspergillus spp en el medio ambiente y, por extensión, la ubicuidad de tales aislados en el sistema respiratorio de sujetos sanos, plantea un gran desafío diagnóstico. Es decir, la diferenciación de IPA de la colonización no invasiva del tracto respiratorio puede ser un desafío. El gran aumento en la prevalencia de pacientes inmunodeprimidos, incluyendo tumores malignos y tratamientos oncológicos, células madre hematopoyéticas y trasplantes de órganos sólidos, y medicamentos inmunomoduladores, acentúa este dilema.(1) En particular, los pacientes con leucemia mielógena aguda (AML) tienen un alto riesgo de desarrollar IPA, con un 5-15 % de dichos pacientes que desarrollan IPA durante los primeros 3 meses después del diagnóstico de AML.(1-3) Dado que hasta el 5 % de los pacientes con AML pueden tener IPA en el momento de la presentación, los pacientes admitidos en el Centro Médico Rambam (RMC) con un nuevo diagnóstico de AML se someten de forma rutinaria a una tomografía computarizada (TC) de tórax, que sirve como detección de la presencia de IPA en el momento del diagnóstico. y una línea de base para futuras referencias en caso de que se sospeche de IPA más adelante.(3) El diagnóstico de IPA probable o comprobada en un paciente con AML requiere hallazgos de imagen sugestivos junto con evidencia microbiológica. Si bien en algunos casos el diagnóstico se puede realizar utilizando biomarcadores (principalmente el antígeno d-galactomanano o la reacción en cadena de la polimerasa de Aspergillus spp) en sangre periférica, la sensibilidad de estos ensayos es baja y, a menudo, este enfoque mínimamente invasivo no brinda suficiente certeza diagnóstica. En tales casos, se suele realizar una broncoscopia con lavado broncoalveolar. Este procedimiento invasivo es particularmente peligroso en pacientes con sospecha de API, la gran mayoría de los cuales son muy frágiles debido a su enfermedad subyacente.(4) Estas consideraciones han llevado a la búsqueda de modalidades adicionales no invasivas en el diagnóstico de la API. (5) Uno de estos enfoques ha sido el análisis de compuestos orgánicos volátiles (COV) en muestras de aire exhalado. Caracterizado por una presión de vapor baja a temperatura ambiente, el análisis del perfil de COV del aire exhalado es un campo emergente de diagnóstico, con el potencial de la detección y el diagnóstico no invasivos de diversas enfermedades, incluidas las neoplasias,(6) las infecciones(7) y los procesos inflamatorios. (8) Estudios previos han identificado marcadores VOC potenciales de Aspergillus spp metabólicamente activo,(9) con un pequeño estudio prospectivo en humanos(10) que muestra un rendimiento diagnóstico alentador para la identificación de IPA basada en VOC. Sin embargo, estos intentos se han visto obstaculizados por varios escollos. En primer lugar, los perfiles de COV de Aspergillus spp in vitro parecen tener poca relación con los COV encontrados en el análisis del aliento de pacientes colonizados.(5) En segundo lugar, los COV exhalados tienden a diferir mucho entre individuos, lo que hace que la ausencia de controles temporales (es decir, cambios en el perfil de COV en el mismo individuo antes y después del desarrollo de IPA) sea una advertencia crucial.(10) En tercer lugar, hasta donde sabemos, ningún estudio longitudinal ha evaluado la respuesta de los perfiles de VOC al tratamiento con IPA.

En este estudio longitudinal prospectivo, nuestro objetivo es superar estos obstáculos aprovechando dos características clave de los pacientes hematológicos tratados en RMC. Primero, los pacientes con LMA recién diagnosticada tienen una prevalencia relativamente alta de API. En segundo lugar, se realiza una TC de tórax en el momento del diagnóstico de AML en todos los pacientes. Por lo tanto, la recolección de muestras de aliento de pacientes con CT basal normal servirá como controles negativos, lo que permitirá la comparación de los perfiles de VOC antes y después del desarrollo de IPA en el mismo paciente. El muestreo adicional después de que el paciente se haya recuperado de la IPA proporcionará un control longitudinal adicional.

OBJETIVOS La identificación de perfiles de VOC predictivos de IPA en muestras de aliento

MÉTODOS

Diseño del estudio:

Este es un estudio de cohorte prospectivo, no aleatorizado y de un solo centro. Las muestras de aliento de los pacientes que hayan dado su consentimiento se analizarán para determinar los perfiles de VOC en el momento de la exploración inicial por TC para IPA. Además, también se recogerán muestras en el momento del diagnóstico de cualquier API posible, probable o confirmada (definida según los criterios de la EORTC (4) como se detalla a continuación).

Escenario y participantes:

Se abordará a los pacientes recién diagnosticados con LMA que inicien tratamiento en el departamento de hematología de RMC. El período de inclusión será desde el 1 de octubre de 2022 hasta el 31 de marzo de 2025.

Criterios de inclusión:

Nuevo diagnóstico de leucemia mieloide aguda Y/O trasplante planificado de células madre hematopoyéticas (HCT) CT de tórax realizada dentro de los 30 días posteriores al muestreo 18 años de edad o más La capacidad de proporcionar muestras de aliento tidal por un total de 10 L directamente en una bolsa Tedlar

Criterio de exclusión:

Cualquier condición que afecte la capacidad del paciente para dar su consentimiento informado.

Coleccion de muestra:

Las muestras de aliento se recolectarán en una de las 23 salas de hospitalización dedicadas de nuestro departamento de hematología, presurizadas positivamente y con clima controlado con filtros E-pure de aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) (ADS-Laminaire, Israel). Los pacientes deberán abstenerse de cepillarse los dientes, lavarse los dientes, comer, beber o fumar en las 6 horas anteriores a la recolección de la muestra. Después de estar sentado durante 10 minutos (para evitar el aumento de la concentración de isopreno inducido por el ejercicio (11)), se le pedirá al paciente que llene 10 L de respiración tidal en una bolsa tedlar (SKC, Corea del Sur). Simultáneamente, se llenará con aire ambiente una bolsa de tedlar idéntica.

En cada toma de muestra, se registrarán los siguientes datos:

Características del paciente, incluida la edad, el diagnóstico hematooncológico, el tiempo transcurrido desde el diagnóstico inicial, el tratamiento actual, el tiempo transcurrido desde el TCH si corresponde, los diagnósticos de antecedentes Tratamiento farmacológico actual, incluidos todos los antibióticos y antifúngicos prescritos el mes anterior.

Pruebas de diagnóstico actuales, incluidos todos los cultivos, ensayos de serología, estudios de amplificación de ácido nucleico, biometría hemática completa y química, nivel plasmático de voriconazol e imágenes de tórax realizadas durante el último mes.

Manipulación de muestras y extracción de COV:

Todas las bolsas de tedlar se almacenarán a 4 ℃ después de la recolección. La adsorción en 2 tubos de desorción térmica paralelos se realizará a través de la bomba de muestreo de aire personal de flujo bajo Gilian LFS-113 (instrumentos SRA, Milán, Italia), realizada dentro de las 72 horas posteriores al muestreo y almacenada en condiciones ambientales. Estas muestras serán etiquetadas (codificadas) y transformadas al Laboratorio de Química Ambiental (Instituto de Química Kasali, Universidad Hebrea de Jerusalén, Israel)

Analítica:

La desorción térmica se logrará a 290 durante 20 minutos utilizando gas helio de grado analítico (99,999%) como portador. La inyección a la espectroscopia de masas por cromatografía de gases en tándem (GC-MS) se realizará a temperaturas de entrada similares que no excedan el flujo de 40 ml/min. El programa de temperatura inicial del GC imitará los (10) protocolos informados anteriormente: 40 ˚C durante 3 minutos, elevado a 70 ˚C a una velocidad de 5 ˚C por minuto y mantenido durante 3 minutos, elevado a 203 ˚C a 7 ˚C por minuto y se mantuvo durante 4 minutos, se elevó rápidamente a 270˚C y se mantuvo durante 5 minutos. Un espectrómetro de masas triple cuádruple (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) se conectará en tándem, con un rango de medición de masas de 20-400 m/z.

El diagnóstico de aspergilosis pulmonar invasiva se definirá según los criterios actualizados de la EORTC (4) como uno de los siguientes:

IPA confirmado definido como una muestra de biopsia respiratoria con cultivo positivo de Aspergillus spp o demostración histopatológica de invasión tisular por hifas.

"IPA probable", definida (1) como características radiográficas compatibles en la TC de tórax (lesión(es) densa(s) bien delimitada(s) con o sin un signo de halo, signo de la media luna de aire o una cavidad) y cualquiera de los siguientes: Evidencia de Aspergillus spp en citología, microscopía directa o cultivo de cualquier muestra respiratoria, incluidos esputo, líquido de lavado broncoalveolar (BAL) o cepillo bronquial Antígeno D-galactomanano positivo detectado en plasma, suero o líquido BAL Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) positiva para Aspergillus spp detectadas en plasma, suero o fluido BAL "Posible IPA", definida (1) como características radiográficas compatibles en la TC de tórax (Lesión(es) densa(s) bien delimitada(s) con o sin un signo de halo, signo de la media luna de aire o una cavidad ) sin hallazgos de laboratorio que lo corroboren.

Dos observadores independientes (I.G. y A.S.) recopilarán información adicional sobre la probabilidad de diagnóstico de IPA al revisar el registro médico electrónico completo (EMR) al final del período de estudio, asignando una puntuación de probabilidad única de 1 a 10 (siendo 1 muy bajo). probabilidad de IPA, 10 correspondiente a casi seguro IPA) en vista del curso clínico completo de la enfermedad.

Variables adicionales y fuentes de datos: para todos los pacientes de la cohorte, la información clínica y epidemiológica se extraerá del sistema de registros médicos electrónicos (EMR) del hospital que se utiliza en nuestro hospital y se recuperará con la ayuda del software MD-clone. Necesitaremos obtener la información personal de los pacientes para poder acceder a sus datos registrados en el seguimiento diario en su historia clínica ya que algunos datos no están codificados. Todos los datos serán posteriormente codificados y despojados de cualquier identificador personal incluyendo nombre, apellido, fecha de nacimiento, número de DNI y dirección. Todos los datos se almacenarán en un disco duro designado a manos del investigador principal. Las fuentes de datos incluirán el archivo del paciente en el registro EMR "prometheus", así como los datos recuperados mediante el software MD-clone. Los datos recopilados incluirán: datos demográficos (edad, sexo), diagnósticos de antecedentes, duración de la estadía y transferencia a otras unidades, resultados de laboratorio, signos vitales registrados y el método de oxigenación utilizado según lo documentado en el seguimiento diario.

Calendario de recogida de muestras: La primera muestra de pacientes que hayan dado su consentimiento incluidos en este estudio se recogerá en un plazo de 7 días a partir de la TC de tórax de referencia. Posteriormente, ante cualquier sospecha clínica de API por parte del médico tratante, sospecha que invariablemente conduce a la realización de una TC de tórax, se recogerán muestras en los 7 días posteriores a la TC de tórax. Se recolectarán muestras adicionales dentro de los 7 días posteriores a la interrupción del tratamiento antimicótico por parte del médico tratante. El cronograma de muestreo, se visualizan en la figura 1.

Figura 1 - Estrategia de muestreo. La intervención de este estudio se limita al muestreo subrayado en rojo negrita; todos los demás pasos son parte del manejo habitual de los pacientes con AML y no se ven afectados de ninguna manera por la participación en este estudio. AML: leucemia mieloide aguda; Dx - Diagnóstico; CT - Tomografía Computarizada; IPA - Aspergilosis Pulmonar Invasiva; Tx - Tratamiento; d/c - descontinuado; GGO - Opacidades en vidrio esmerilado.

Manejo de datos y análisis estadístico:

Los datos clínicos se analizarán utilizando estadísticas descriptivas, pruebas paramétricas y no paramétricas, según corresponda. Todos los análisis estadísticos se realizarán utilizando el software R versión 4.0.0 ("Día del árbol") o posterior. El investigador principal almacenará todos los datos identificables, incluidas las características iniciales del paciente, los resultados de laboratorio y de imágenes y los registros de diagnósticos y tratamientos previos, en un dispositivo de memoria de fase sólida encriptado RAS designado durante la duración del estudio. Los nombres de los pacientes, los números de identificación, la dirección y la fecha de nacimiento no se almacenarán.

Los resultados de la espectroscopia de masas se revisarán utilizando la estación de trabajo y el software MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). El análisis de discriminación por mínimos cuadrados parciales se realizará utilizando el software SIMCA versión 14.0 o posterior (MKS Umetrics, Suecia). Para cada rango m/z, se construirá un modelo de regresión logística que permita calcular la importancia variable para la proyección (VIP). Para todos los VIP ≥1, el perfil de iones correspondiente se seleccionará como objetivo potencial. Estos se compararán con los metabolitos previamente implicados indicativos de IPA, (10,11) así como con nuestra base de datos existente, como se resume en el APÉNDICE A. Dicha identificación es crucial ya que el mismo valor de m/z puede corresponder a diferentes metabolitos, ya que diferentes sustancias pueden tener la misma relación de carga de germoplasma. A continuación, todas las sustancias identificadas se confirmarán con la Biblioteca de espectros de masas 11 del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) (Scientific Instrument Services, Ringoes, Nueva Jersey) y un estándar químico puro. Finalmente, la matriz digital compuesta por los VOC característicos seleccionados se importará a python (versión 3.10.5 o posterior) para construir diferentes modelos de clasificación, con desempeños predictivos evaluados por regresión logística binaria. Las correlaciones entre los niveles de expresión de VOC en el aliento exhalado y los niveles de d-galactomanano en suero y BAL y la certeza diagnóstica de IPA (confirmado, probable o posible, como se define a continuación) se realizarán utilizando la r de Person.

Tamaño de la muestra y potencia:

En este estudio longitudinal prospectivo, los pacientes con alta probabilidad de desarrollar API (es decir, pacientes diagnosticados con leucemia aguda) se inscribirán en el momento del diagnóstico. Dado que nuestro centro realiza una tomografía computarizada de tórax de referencia para identificar IPA potencial en la línea de base, los COV recopilados después de una radiografía normal pueden servir como amplios controles. Al menos el 15 % de estos pacientes desarrollan API en los meses siguientes,(3) lo que limita el tamaño de muestra necesario en el momento del reclutamiento. Sobre la base de la adherencia al seguimiento informada previamente,(12) esperamos que la tasa de abandono sea baja, lo que permite la detección de cambios posteriores al tratamiento previamente esquivos en los perfiles de VOC.

A los fines de estos cálculos, asumimos la sensibilidad de los ensayos de VOC informados anteriormente (en comparación con la microbiología o las pruebas de antígenos en secreciones respiratorias, BAL o suero del paciente) del 80-95 % cada uno.(10) Encuestas retrospectivas recientes han identificado que la incidencia de API es del 5 % en la TC de detección inicial y del 10 % adicional durante la hospitalización inicial.(3) Esto se traduce en un tamaño de muestra estimado de 124 pacientes, calculado bajo el supuesto de la significancia (alfa = 0,05) y potencia (beta = 0,8) aceptada. Teniendo en cuenta una inscripción estimada del 70 % y la tasa de exclusión adicional del 15 %, el tamaño total estimado de la muestra es de 208 pacientes. Proyectando la incidencia anual promedio de 90 casos nuevos de leucemia aguda tratados en nuestro hospital, este objetivo de muestreo debe alcanzarse fácilmente dentro del período de reclutamiento de 30 meses especificado previamente. Por lo tanto, esperamos que el número de participantes sea de 300.

CONSIDERACIONES ÉTICAS El desarrollo y mejora de técnicas no invasivas para la identificación de API ha sido el objetivo declarado de varias sociedades profesionales durante más de dos décadas. (1,4) La herramienta de diagnóstico propuesta por los pacientes presenta molestias mínimas o nulas para los participantes, y consideramos que los posibles efectos secundarios y el peligro son insignificantes en esta modalidad completamente no invasiva.

Después de la extracción de datos, todos los datos serán despojados de cualquier identificación, incluido el nombre, apellido, número de identificación, número de caso, fecha de nacimiento y dirección, todo destruido cuando se complete la extracción de datos inicial. Los datos se almacenarán de forma segura en un dispositivo SD designado con encriptación RAS en manos del PI, lo que minimiza la probabilidad de que este estudio afecte la privacidad de los datos o la confidencialidad médica de los pacientes incluidos. En vista del efecto directo que los resultados de esta investigación pueden tener sobre el manejo y el pronóstico de los pacientes gravemente enfermos, consideramos que los beneficios de este estudio superan cualquier riesgo potencial.

Financiamiento Hasta el momento, no se proporcionó financiamiento externo para este estudio.

Bibliografía

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. Un algoritmo clínico para diagnosticar aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes críticos. Am J Respir Crit Care Med. 2012 1 de julio; 186 (1): 56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et al. Epidemiología de la enfermedad fúngica invasiva en pacientes hematológicos. Micosis. 2021 marzo;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y, et al. Tomografía computarizada de tórax basal para el diagnóstico precoz de aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes hemato-oncológicos: un estudio de cohorte prospectivo. Clin Infect Dis. 30 de octubre de 2019;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et al. Revisión y actualización de las definiciones de consenso de enfermedad fúngica invasiva de la organización europea para la investigación y el tratamiento del cáncer y el consorcio de educación e investigación del grupo de estudio de micosis. Clin Infect Dis. 12 de septiembre de 2020; 71 (6): 1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Nuevas herramientas de diagnóstico basadas en metabolitos de última generación para la aspergilosis. Patog de PLoS. 7 de septiembre de 2017; 13 (9): e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang H-C, Chang C-J, Liang S-K, et al. Exploración de compuestos orgánicos volátiles en el aliento para la predicción de alta precisión del cáncer de pulmón. Cánceres (Basilea). 2021 21 de marzo; 13 (6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et al. Los compuestos orgánicos volátiles inducidos por virus son detectables en el aliento exhalado durante la infección pulmonar. Am J Respir Crit Care Med. 1 de noviembre de 2021; 204 (9): 1075-85.
8. Castro-Rodríguez JA, Cifuentes L, Martínez FD. Predicción del asma mediante índices clínicos. Pediatría frontal 31 de julio de 2019; 7:320.
9. Das S, Pal M. Revisión: Monitoreo no invasivo de la salud humana mediante el análisis de la respiración exhalada: una revisión integral. J Electrochem Soc. 3 de febrero de 2020; 167 (3): 037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM, et al. Una firma de metabolitos secundarios fúngicos del aliento para diagnosticar la aspergilosis invasiva. Clin Infect Dis. 2014 15 de diciembre; 59 (12): 1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y, et al. Compuestos orgánicos volátiles exhalados para la identificación de pacientes con aspergilosis pulmonar crónica. Front Med (Lausana). 2021 23 de septiembre;8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Papel diagnóstico de la reacción en cadena de la polimerasa en el líquido de lavado broncoalveolar para la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes inmunocomprometidos: un estudio de cohorte retrospectivo. Int J Infect Dis. 2019 junio;83:20-5.