VOS in ademmonsters voor de diagnose van IPA

ACHTERGROND De diagnose van invasieve pulmonale aspergillose (IPA) heeft ernstige gevolgen voor de prognose en het behandelplan van de patiënt met immunosuppressie. De alomtegenwoordigheid van Aspergillus spp in het milieu, en bij uitbreiding de alomtegenwoordigheid van dergelijke isolaten in het ademhalingssysteem van gezonde proefpersonen, vormt een grote diagnostische uitdaging. Het onderscheid tussen IPA en niet-invasieve kolonisatie van de luchtwegen kan namelijk een uitdaging zijn. De enorme toename van de prevalentie van patiënten met immunosuppressie, waaronder maligniteiten en oncologische behandelingen, hematopoëtische stamcellen en solide orgaantransplantaties, en immunomodulerende medicatie, accentueert dit dilemma.(1) Met name patiënten met acute myeloïde leukemie (AML) lopen een hoog risico om IPA te ontwikkelen, waarbij 5-15% van dergelijke patiënten IPA ontwikkelt gedurende de eerste 3 maanden na de diagnose van AML.(1-3) Aangezien tot 5% van de patiënten met AML mogelijk IPA heeft bij presentatie, ondergaan patiënten die zijn opgenomen in het Rambam Medical Center (RMC) met een nieuwe diagnose van AML routinematig computertomografie (CT), die dient als screening op de aanwezigheid van IPA bij diagnose en een basislijn voor verdere referentie mocht IPA later worden vermoed.(3) Diagnose van waarschijnlijke of bewezen IPA bij een AML-patiënt vereist suggestieve beeldvormingsbevindingen samen met microbiologisch bewijs. Hoewel in sommige gevallen de diagnose kan worden gesteld met behulp van biomarkers (voornamelijk het d-galactomannan-antigeen en/of Aspergillus spp-polymerasekettingreactie) in perifeer bloed, is de gevoeligheid van deze assays laag en levert deze minimaal invasieve benadering vaak onvoldoende diagnostische zekerheid op. In dergelijke gevallen wordt meestal bronchoscopie met bronchoalveolaire lavage uitgevoerd. Deze invasieve procedure is bijzonder gevaarlijk bij patiënten met verdenking op IPA, van wie de overgrote meerderheid erg kwetsbaar is vanwege hun onderliggende ziekte.(4) Deze overwegingen hebben geleid tot de zoektocht naar aanvullende, niet-invasieve modaliteiten bij de diagnose van IPA. (5) Een van die benaderingen is de analyse van vluchtige organische stoffen (VOS) in uitgeademde luchtmonsters. Gekenmerkt door een lage dampdruk bij kamertemperatuur, is VOC-profielanalyse van uitgeademde lucht een opkomend diagnostisch gebied, met het potentieel van niet-invasieve screening en diagnose van verschillende ziekten, waaronder neoplasmata,(6) infecties(7) en ontstekingsprocessen. (8) Eerdere studies hebben potentiële VOS-markers van metabolisch actieve Aspergillus spp(9) geïdentificeerd, waarbij één kleine prospectieve studie bij mensen(10) bemoedigende diagnostische prestaties voor op VOS gebaseerde IPA-identificatie liet zien. Deze pogingen werden echter gehinderd door verschillende valkuilen. Ten eerste lijken VOS-profielen van in vitro Aspergillus spp weinig verband te houden met VOS gevonden in ademanalyse van gekoloniseerde patiënten.(5) Ten tweede hebben uitgeademde VOC's de neiging sterk te verschillen tussen individuen, waardoor de afwezigheid van temporele controles (d.w.z. VOC-profielveranderingen bij dezelfde persoon voor en na IPA-ontwikkeling) een cruciaal voorbehoud is.(10) Ten derde, voor zover wij weten, hebben geen longitudinale studies de respons van VOS-profielen op IPA-behandeling beoordeeld.

In deze prospectieve longitudinale studie streven we ernaar deze hindernissen te overwinnen door gebruik te maken van twee belangrijke kenmerken van hematologische patiënten die in RMC worden behandeld. Ten eerste hebben patiënten met nieuw gediagnosticeerde AML een relatief hoge prevalentie van IPA. Ten tweede wordt bij alle patiënten een thorax-CT uitgevoerd bij de diagnose AML. Het verzamelen van ademmonsters van patiënten met een normale basislijn-CT zal dus dienen als negatieve controles, waardoor VOC-profielen voor en na de ontwikkeling van IPA bij dezelfde patiënt kunnen worden vergeleken. Verdere bemonstering nadat de patiënt is hersteld van IPA zal zorgen voor extra longitudinale controle.

DOELSTELLINGEN Identificatie van VOS-profielen die voorspellend zijn voor IPA in ademmonsters

METHODEN

Studie ontwerp:

Dit is een single-center, niet-gerandomiseerde, prospectieve cohortstudie. Ademmonsters van instemmende patiënten zullen worden geanalyseerd op VOS-profielen op het moment van de eerste CT-screening op IPA. Bovendien zullen er ook monsters worden genomen op het moment van diagnose van een mogelijke, waarschijnlijke of bevestigde IPA (gedefinieerd volgens de EORTC-criteria (4) zoals hieronder beschreven).

Instelling en deelnemers:

Patiënten bij wie recent AML is vastgesteld en die een behandeling starten op de afdeling hematologie van het RMC, zullen worden benaderd. De opnameperiode loopt van 1 oktober 2022 tot en met 31 maart 2025.

Inclusiecriteria:

Nieuwe diagnose van acute myeloïde leukemie EN/OF geplande hematopoëtische stamceltransplantatie (HCT) CT-thorax uitgevoerd binnen 30 dagen na bemonstering 18 jaar of ouder De mogelijkheid om getijde-ademmonsters van in totaal 10L rechtstreeks in een Tedlar-zak te leveren

Uitsluitingscriteria:

Elke aandoening die het vermogen van de patiënt om geïnformeerde toestemming te geven, aantast

Voorbeeldverzameling:

Ademmonsters worden verzameld in een van de 23 speciale ziekenhuiskamers van onze hematologische afdeling - onder positieve druk en klimaatgecontroleerd met E-pure high-efficiency particulate air (HEPA) filters (ADS-Laminaire, Israël). Patiënten moeten zich onthouden van tandenpoetsen, tandenpoetsen, eten, drinken of roken in de 6 uur voorafgaand aan de monsterafname. Na 10 minuten zitten (om te voorkomen dat de isopreenconcentratie door inspanning toeneemt (11) ), wordt de patiënt gevraagd om 10 liter getijde-ademhaling in een tedlar bag (SKC, Zuid-Korea) te doen. Tegelijkertijd wordt een identieke tedlar bag gevuld met omgevingslucht.

Bij elke monsterafname worden de volgende gegevens geregistreerd:

Patiëntkenmerken, waaronder leeftijd, hemato-oncologische diagnose, tijd vanaf eerste diagnose, huidige behandeling, tijd vanaf HCT indien van toepassing, achtergronddiagnoses Huidige farmacologische behandeling, inclusief alle antibiotica en antischimmelmiddelen die de voorgaande maand zijn voorgeschreven.

Huidige diagnostische tests, inclusief alle culturen, serologische assays, nucleïnezuuramplificatieonderzoeken, volledig bloedbeeld en chemie, voriconazol-plasmaspiegel en beeldvorming van de borstkas uitgevoerd in de afgelopen maand.

Monsterbehandeling en VOS-extractie:

Alle tedlarbags worden na ophaling opgeslagen bij 4℃. Adsorptie op 2 parallelle thermische desorptiebuizen wordt uitgevoerd via Gilian LFS-113 Low Flow Personal Air Sampling Pump (SRA-instrumenten, Milaan, Italië), uitgevoerd binnen 72 uur na monstername en opgeslagen onder omgevingsomstandigheden. Deze monsters worden gelabeld (gecodeerd) en getransformeerd naar het Environmental Chemistry Laboratory (Kasali Institute of Chemistry, Hebrew University of Jerusalem, Israel)

Analyse:

Thermische desorptie vindt plaats bij 290°C gedurende 20 minuten met heliumgas van analytische kwaliteit (99,999%) als drager. Injectie-naar-tandemgaschromatografie massaspectroscopie (GC-MS) wordt uitgevoerd bij vergelijkbare inlaattemperaturen die de stroom van 40 ml/min niet overschrijden. Het initiële GC-temperatuurprogramma zal eerder gerapporteerde (10) protocollen nabootsen: 40˚C gedurende 3 minuten, verhoogd tot 70˚C met een snelheid van 5˚C per minuut en gedurende 3 minuten vastgehouden, verhoogd tot 203˚C bij 7˚C per minuut en 4 minuten vastgehouden, snel verhoogd tot 270˚C en 5 minuten vastgehouden. Een triple quad massaspectrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) wordt achter elkaar aangesloten, met een massametingsbereik van 20-400 m/z.

De diagnose van invasieve pulmonale aspergillose zal worden gedefinieerd volgens de bijgewerkte EORTC-criteria (4) als een van de volgende:

Bevestigde IPA gedefinieerd als een respiratoir biopsiemonster met positieve kweek van Aspergillus spp of histopathologische demonstratie van weefselinvasie door hyfen.

"Waarschijnlijke IPA", gedefinieerd (1) als compatibele radiografische kenmerken op thorax-CT (Dense, goed omschreven laesie(s) met of zonder een halo-teken, lucht-halve maan-teken of een holte) en een van de volgende: Bewijs van Aspergillus spp na cytologie, directe microscopie of kweek van elk ademhalingsspecimen, inclusief sputum, broncho-alveolaire lavage (BAL)-vloeistof of bronchiale borstel Positief D-galactomannan-antigeen gedetecteerd in plasma, serum of BAL-vloeistof Positieve polymerasekettingreactie (PCR) voor Aspergillus spp gedetecteerd in plasma, serum of BAL-vloeistof "Mogelijke IPA", gedefinieerd (1) als compatibele radiografische kenmerken op thorax-CT (Dense, goed omschreven laesie(s) met of zonder een halo-teken, lucht-halve maan teken of een holte ) zonder bevestigende laboratoriumbevindingen.

Aanvullende informatie over de waarschijnlijkheid van IPA-diagnose zal worden verzameld door twee onafhankelijke waarnemers (I.G. en A.S.) die het volledige elektronische medische dossier (EMR) aan het einde van de onderzoeksperiode beoordelen, waarbij een enkele waarschijnlijkheidsscore van 1-10 wordt toegekend (waarbij 1 zeer laag is waarschijnlijkheid van IPA, 10 komt overeen met vrijwel zekere IPA) met het oog op het volledige klinische beloop van de ziekte.

Aanvullende variabelen en gegevensbronnen: Voor alle cohortpatiënten zal epidemiologische en klinische informatie worden geëxtraheerd uit het systeem voor elektronische medische dossiers (EMR) van het ziekenhuis dat in ons ziekenhuis wordt gebruikt en wordt opgehaald met behulp van de MD-clone-software. We zullen de persoonlijke informatie van patiënten moeten verkrijgen om toegang te krijgen tot hun gegevens die zijn vastgelegd in de dagelijkse follow-up in hun medische dossier, aangezien sommige gegevens niet gecodeerd zijn. Alle gegevens worden later gecodeerd en ontdaan van alle persoonlijke identificatiegegevens, waaronder naam, achternaam, geboortedatum, ID-nummer en adres. Alle gegevens worden opgeslagen op een aangewezen harde schijf in handen van de hoofdonderzoeker. Gegevensbronnen omvatten het dossier van de patiënt in het "prometheus" EMR-register, evenals opgehaalde gegevens met behulp van MD-clone-software. De verzamelde gegevens omvatten: demografische gegevens (leeftijd, geslacht), achtergronddiagnoses, verblijfsduur en overplaatsing naar andere afdelingen, laboratoriumresultaten, geregistreerde vitale functies en de gebruikte oxygenatiemethode zoals gedocumenteerd in de dagelijkse follow-up.

Schema voor het verzamelen van monsters: het eerste monster van instemmende patiënten die aan dit onderzoek deelnemen, wordt binnen 7 dagen na baseline-thorax-CT verzameld. Vervolgens, na een klinisch vermoeden van IPA door de behandelend arts - een vermoeden dat steevast leidt tot het uitvoeren van een thorax-CT, zullen monsters worden genomen binnen 7 dagen na de thorax-CT. Binnen 7 dagen na stopzetting van de antischimmelbehandeling door de behandelend arts zullen aanvullende monsters worden afgenomen. Het bemonsteringsschema wordt gevisualiseerd in figuur 1.

Figuur 1 - Bemonsteringsstrategie. De tussenkomst van deze studie is beperkt tot steekproeven die vetgedrukt rood zijn onderstreept - alle andere stappen maken deel uit van de gebruikelijke behandeling van AML-patiënten en worden op geen enkele manier beïnvloed door deelname aan deze studie. AML - Acute myeloïde leukemie; Dx - Diagnose; CT - Computertomografie; IPA - Invasieve pulmonale aspergillose; Tx - Behandeling; d/c - stopgezet; GGO - Ondoorzichtigheden van geslepen glas.

Gegevensverwerking en statistische analyse:

Klinische gegevens worden geanalyseerd met behulp van beschrijvende statistiek, parametrische en niet-parametrische tests, naargelang het geval. Alle statistische analyses worden uitgevoerd met R-softwareversie 4.0.0 ("Arbor day") of later. Alle identificeerbare gegevens, inclusief de uitgangskenmerken van de patiënt, laboratorium- en beeldvormingsresultaten en eerdere diagnoses en behandelingsgegevens, worden door de hoofdonderzoeker opgeslagen op een aangewezen RAS-gecodeerd solid-phase-geheugenapparaat voor de duur van het onderzoek. Namen, ID-nummers, adres en geboortedatum van de patiënt worden niet opgeslagen.

Massaspectroscopie-outputs zullen worden beoordeeld met behulp van het MassHunter-werkstation en de software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Gedeeltelijke kleinste-kwadraten-discriminatieanalyse zal worden uitgevoerd met behulp van de SIMCA-softwareversie 14.0 of hoger (MKS Umetrics, Zweden). Voor elk m/z-bereik zal een logistisch regressiemodel worden geconstrueerd, waarmee de variabele belangrijkheid voor projectie (VIP) kan worden berekend. Voor alle VIP's ≥1 wordt het overeenkomstige ionenprofiel als potentieel doelwit geselecteerd. Deze zullen worden vergeleken met eerder geïmpliceerde metabolieten die indicatief zijn voor IPA, (10,11) en ook met onze bestaande database, zoals samengevat in BIJLAGE A. Een dergelijke identificatie is cruciaal omdat dezelfde m/z-waarde kan overeenkomen met verschillende metabolieten, aangezien verschillende stoffen kunnen dezelfde kiemplasma-ladingsverhouding hebben. Vervolgens zullen alle geïdentificeerde stoffen worden bevestigd aan de hand van de National Institute of Standards and Technology (NIST) 11 Mass Spectral Library (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) en een zuiver chemische standaard. Ten slotte zal de digitale matrix bestaande uit de geselecteerde karakteristieke VOC's worden geïmporteerd in python (versie 3.10.5 of hoger) om verschillende classificatiemodellen te construeren, met voorspellende prestaties beoordeeld door binaire logistische regressie. De correlaties tussen uitgeademde VOS-expressieniveaus en niveaus van serum en BAL d-gallactomannan en IPA diagnostische zekerheid (bevestigd, waarschijnlijk of mogelijk, zoals hieronder gedefinieerd) zullen worden bereikt met behulp van Person's r.

Steekproefgrootte en vermogen:

In deze prospectieve longitudinale studie zullen patiënten met een hoge waarschijnlijkheid om IPA te ontwikkelen (d.w.z. patiënten met de diagnose acute leukemie) worden ingeschreven bij de diagnose. Aangezien ons centrum baseline CT-screening op de borst uitvoert om potentiële IPA bij baseline te identificeren, kan VOS verzameld na normale radiografie dienen als voldoende controles. Minstens 15% van dergelijke patiënten ontwikkelt IPA in de daaropvolgende maanden,(3) waardoor de steekproefomvang die nodig is bij rekrutering wordt beperkt. Op basis van eerder gerapporteerde therapietrouw(12) verwachten we dat het aantal uitvallers laag zal zijn, waardoor eerder ongrijpbare veranderingen in VOC-profielen na de behandeling kunnen worden gedetecteerd.

Voor deze berekeningen gingen we uit van de eerder gerapporteerde gevoeligheid van de VOC-assays (vergeleken met microbiologie of antigeentesten in respiratoire secreties, BAL of patiëntenserum) van elk 80-95%.(10) Recente retrospectieve onderzoeken hebben aangetoond dat de incidentie van IPA 5% is bij de eerste CT-screening en nog eens 10% tijdens de eerste ziekenhuisopname.(3) Dit vertaalt zich in een geschatte steekproefomvang van 124 patiënten, berekend onder de aanname van de geaccepteerde significantie (alfa = 0,05) en power (bèta = 0,8). Rekening houdend met een geschatte inschrijving van 70% en het extra uitsluitingspercentage van 15%, is de totale geschatte steekproefomvang 208 patiënten. Als we uitgaan van de gemiddelde jaarlijkse incidentie van 90 nieuwe gevallen van acute leukemie die in ons ziekenhuis worden behandeld, zou dit steekproefdoel gemakkelijk moeten worden bereikt binnen de vooraf gespecificeerde rekruteringsperiode van 30 maanden. We verwachten dus dat het aantal deelnemers 300 zal zijn.

ETHISCHE OVERWEGINGEN De ontwikkeling en verbetering van niet-invasieve technieken voor IPA-identificatie is al meer dan twee decennia het verklaarde doel van verschillende professionele verenigingen. (1,4) Het door de patiënten voorgestelde diagnostische hulpmiddel veroorzaakt weinig tot geen ongemak voor de deelnemers, en we achten potentiële bijwerkingen en gevaren te verwaarlozen in deze volledig niet-invasieve modaliteit.

Na de gegevensextractie worden alle gegevens ontdaan van elke identificatie, inclusief naam, achternaam, ID-nummer, dossiernummer, geboortedatum en adres - allemaal vernietigd wanneer de eerste gegevensextractie is voltooid. Gegevens worden veilig opgeslagen op een RAS-gecodeerd, aangewezen SD-apparaat in handen van de PI, waardoor de kans dat dit onderzoek de gegevensprivacy of medische vertrouwelijkheid van de opgenomen patiënten aantast, wordt geminimaliseerd. Gezien het directe effect dat de resultaten van dit onderzoek kunnen hebben op het management en de prognose van ernstig zieken, zijn wij van mening dat de voordelen van dit onderzoek opwegen tegen de mogelijke risico's.

Financiering Voor dit onderzoek is tot nu toe geen externe financiering verstrekt.

Bibliografie

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. Een klinisch algoritme om invasieve pulmonale aspergillose te diagnosticeren bij ernstig zieke patiënten. Am J Respir Crit Care Med. 1 juli 2012;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et al. Epidemiologie van invasieve schimmelziekte bij hematologische patiënten. mycosen. 2021 mrt;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y, et al. Baseline thoraxcomputertomografie voor vroege diagnose van invasieve pulmonale aspergillose bij hemato-oncologische patiënten: een prospectieve cohortstudie. Clin Infect Dis. 30 oktober 2019;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et al. Herziening en actualisering van de consensusdefinities van invasieve schimmelziekte van de europese organisatie voor onderzoek en behandeling van kanker en het mycoses studiegroep onderwijs- en onderzoeksconsortium. Clin Infect Dis. 12 september 2020;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Nieuwe geavanceerde op metabolieten gebaseerde diagnostische hulpmiddelen voor aspergillose. PLoS Pathhog. 7 september 2017;13(9):e1006486.
6. Tsou PH, Lin ZL, Pan YC, Yang HC, Chang CJ, Liang SK, et al. Onderzoek naar vluchtige organische stoffen in adem voor zeer nauwkeurige voorspelling van longkanker. Kankers (Basel). 21 maart 2021;13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et al. Door virussen geïnduceerde vluchtige organische stoffen zijn detecteerbaar in uitgeademde adem tijdens longinfectie. Am J Respir Crit Care Med. 1 nov 2021;204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Astma voorspellen met behulp van klinische indexen. Front Pediatr. 31 juli 2019;7:320.
9. Das S, Pal M. Review-niet-invasieve monitoring van de menselijke gezondheid door analyse van uitgeademde adem: een uitgebreide beoordeling. J Electrochem Soc. 3 februari 2020;167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM, et al. Een handtekening van een secundaire metaboliet van een ademschimmel om invasieve aspergillose te diagnosticeren. Clin Infect Dis. 15 december 2014;59(12):1733-40.
11. Li ZT, Zeng PY, Chen ZM, Guan WJ, Wang T, Lin Y, et al. Uitgeademde vluchtige organische stoffen voor het identificeren van patiënten met chronische pulmonale aspergillose. Front Med (Lausanne). 23 september 2021;8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Diagnostische rol van polymerasekettingreactie in bronchoalveolaire lavagevloeistof voor invasieve pulmonale aspergillose bij immuungecompromitteerde patiënten - Een retrospectieve cohortstudie. Int J Infect Dis. 2019 juni;83:20-5.