COV em amostras de respiração para o diagnóstico de IPA

HISTÓRICO O diagnóstico de aspergilose pulmonar invasiva (API) traz sérias implicações para o prognóstico e plano de tratamento do paciente imunossuprimido. A onipresença de Aspergillus spp no ​​ambiente e, por extensão, a ubiquidade desses isolados no sistema respiratório de indivíduos saudáveis, representa um grande desafio diagnóstico. Ou seja, a diferenciação da IPA da colonização não invasiva do trato respiratório pode ser um desafio. O grande aumento na prevalência de pacientes imunossuprimidos, incluindo neoplasias e tratamentos oncológicos, transplantes de células-tronco hematopoiéticas e de órgãos sólidos e medicamentos imunomoduladores, acentua esse dilema.(1) Particularmente, pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) têm alto risco de desenvolver API, com 5-15% desses pacientes desenvolvendo API durante os primeiros 3 meses após o diagnóstico de LMA.(1-3) Como até 5% dos pacientes com LMA podem ter IPA na apresentação, os pacientes internados no Rambam Medical Center (RMC) com um novo diagnóstico de LMA são rotineiramente submetidos a tomografia computadorizada (TC) de tórax, que serve como triagem para a presença de IPA no momento do diagnóstico e uma linha de base para referência futura caso haja suspeita de IPA posteriormente.(3) O diagnóstico de IPA provável ou comprovada em um paciente com LMA requer achados de imagem sugestivos, juntamente com evidências microbiológicas. Embora em alguns casos o diagnóstico possa ser feito usando biomarcadores (principalmente o antígeno d-galactomanano e/ou reação em cadeia da polimerase de Aspergillus spp) no sangue periférico, a sensibilidade desses ensaios é baixa e, muitas vezes, essa abordagem minimamente invasiva não produz certeza diagnóstica suficiente. Nesses casos, costuma-se realizar broncoscopia com lavado broncoalveolar. Este procedimento invasivo é particularmente perigoso em pacientes com suspeita de API, a grande maioria dos quais é muito frágil devido à sua doença subjacente.(4) Essas considerações levaram à busca de modalidades adicionais não invasivas no diagnóstico da API. (5) Uma dessas abordagens tem sido a análise de compostos orgânicos voláteis (VOC) em amostras de ar exalado. Caracterizada pela baixa pressão de vapor à temperatura ambiente, a análise do perfil de VOC do ar exalado é um campo emergente de diagnóstico, com potencial para triagem e diagnóstico não invasivo de várias doenças, incluindo neoplasias,(6) infecções(7) e processos inflamatórios. (8) Estudos anteriores identificaram potenciais marcadores de VOC de Aspergillus spp metabolicamente ativos,(9) com um pequeno estudo prospectivo em humanos(10) mostrando desempenho diagnóstico encorajador para identificação de IPA baseada em VOC. No entanto, essas tentativas foram prejudicadas por várias armadilhas. Em primeiro lugar, os perfis de VOC de Aspergillus spp in vitro parecem ter pouca relação com os VOCs encontrados na análise da respiração de pacientes colonizados.(5) Em segundo lugar, os VOCs exalados tendem a diferir muito entre os indivíduos, tornando a ausência de controles temporais (ou seja, mudanças no perfil de VOC no mesmo indivíduo antes e depois do desenvolvimento da IPA) uma ressalva crucial.(10) Em terceiro lugar, até onde sabemos, nenhum estudo longitudinal avaliou a resposta dos perfis de VOC ao tratamento com IPA.

Neste estudo longitudinal prospectivo, pretendemos superar esses obstáculos aproveitando duas características principais de pacientes hematológicos tratados em RMC. Primeiro, os pacientes com LMA recém-diagnosticada têm uma prevalência relativamente alta de IPA. Em segundo lugar, uma TC de tórax é realizada no diagnóstico de LMA em todos os pacientes. Assim, a coleta de amostras respiratórias de pacientes com TC basal normal servirá como controle negativo, permitindo a comparação dos perfis de VOC antes e depois do desenvolvimento de IPA no mesmo paciente. Amostras adicionais após a recuperação do paciente da IPA fornecerão controle longitudinal adicional.

OBJETIVOS A identificação de perfis VOC preditivos de IPA em amostras de respiração

MÉTODOS

Design de estudo:

Este é um estudo de coorte prospectivo de centro único, não randomizado. Amostras de respiração de pacientes consentidos serão analisadas para perfis de VOC no momento da triagem inicial de TC para IPA. Além disso, amostras também serão coletadas no momento do diagnóstico de qualquer IPA possível, provável ou confirmada (definida de acordo com os critérios da EORTC (4) conforme detalhado abaixo).

Cenário e participantes:

Serão abordados pacientes recém-diagnosticados com LMA iniciando tratamento no departamento de hematologia do RMC. O período de inclusão será de 1º de outubro de 2022 até 31 de março de 2025.

Critério de inclusão:

Novo diagnóstico de leucemia mielóide aguda E/OU transplante planejado de células-tronco hematopoiéticas (HCT) TC de tórax realizada dentro de 30 dias a partir da coleta 18 anos de idade ou mais A capacidade de fornecer amostras de respiração corrente totalizando 10L diretamente em uma bolsa Tedlar

Critério de exclusão:

Qualquer condição que prejudique a capacidade do paciente de fornecer consentimento informado

Coleta de amostras:

Amostras respiratórias serão coletadas em uma das 23 salas de internação exclusivas do nosso departamento hematológico - pressurizadas positivamente e climatizadas com filtros de ar particulado E-puro de alta eficiência (HEPA) (ADS-Laminaire, Israel). Os pacientes serão obrigados a se abster de escovar os dentes, lavar os dentes, comer, beber ou fumar nas 6 horas anteriores à coleta da amostra. Depois de ficar sentado por 10 minutos (para evitar o aumento da concentração de isopreno induzido pelo exercício (11) ), o paciente será solicitado a encher 10L de respiração corrente em uma bolsa tedlar (SKC, Coréia do Sul). Simultaneamente, um saco de tedlar idêntico deve ser preenchido com ar ambiente.

A cada coleta de amostra, os seguintes dados serão registrados:

Características do paciente, incluindo idade, diagnóstico hemato-oncológico, tempo desde o diagnóstico inicial, tratamento atual, tempo desde o HCT, se aplicável, diagnósticos prévios Tratamento farmacológico atual, incluindo todos os antibióticos e antifúngicos prescritos no mês anterior.

Testes diagnósticos atuais, incluindo todas as culturas, ensaios sorológicos, estudos de amplificação de ácidos nucleicos, hemograma e química completos, nível plasmático de voriconazol e imagens do tórax realizadas durante o último mês.

Manuseio de amostras e extração de VOC:

Todos os sacos de tedlar serão armazenados a 4℃ após a coleta. A adsorção em 2 tubos de dessorção térmica paralelos deve ser realizada através da bomba de amostragem de ar pessoal de baixo fluxo Gilian LFS-113 (instrumentos SRA, Milano, Itália), realizada dentro de 72 horas a partir da amostragem e armazenada em condições ambientais. Essas amostras serão rotuladas (codificadas) e transformadas para o Laboratório de Química Ambiental (Instituto de Química Kasali, Universidade Hebraica de Jerusalém, Israel)

Análise:

A dessorção térmica será realizada a 290 por 20 minutos usando gás hélio de grau analítico (99,999%) como transportador. A injeção na espectroscopia de massa de cromatografia gasosa em tandem (GC-MS) deve ser realizada em temperaturas de entrada semelhantes, não excedendo o fluxo de 40 mL/min. O programa inicial de temperatura do GC imitará os protocolos relatados anteriormente (10): 40˚C por 3 minutos, aumentado para 70˚C a uma taxa de 5˚C por minuto e mantido por 3 minutos, aumentado para 203˚C a 7˚C por minuto e mantida por 4 minutos, elevada rapidamente para 270˚C e mantida por 5 minutos. Um espectrômetro de massa triple quad (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) deve ser conectado em tandem, com uma faixa de medição de massa de 20-400 m/z.

O diagnóstico de Aspergilose Pulmonar Invasiva será definido de acordo com os critérios EORTC atualizados (4) como um dos seguintes:

IPA confirmada definida como uma amostra de biópsia respiratória com cultura positiva de Aspergillus spp ou demonstração histopatológica de invasão tecidual por hifas.

"Provável API", definido (1) como características radiográficas compatíveis na TC de tórax (lesão(ões) densa(s) bem circunscrita(s) com ou sem sinal de halo, sinal de crescente aéreo ou cavidade) e qualquer um dos seguintes: Evidência de Aspergillus spp após citologia, microscopia direta ou cultura de qualquer espécime respiratório, incluindo escarro, líquido de lavagem broncoalveolar (BAL) ou escova brônquica Antígeno D-galactomanano positivo detectado no plasma, soro ou líquido BAL Reação em cadeia da polimerase (PCR) positiva para Aspergillus spp detectado no plasma, soro ou líquido BAL "Possível IPA", definido (1) como características radiográficas compatíveis na TC de tórax (lesão(ões) densa(s) bem circunscrita(s) com ou sem sinal de halo, sinal de crescente aéreo ou cavidade ) sem achados laboratoriais corroborativos.

Informações adicionais sobre a probabilidade de diagnóstico de IPA serão coletadas por dois observadores independentes (I.G. e A.S.) revisando o registro médico eletrônico completo (EMR) no final do período de estudo, atribuindo uma pontuação de probabilidade única 1-10 (1 sendo muito baixo probabilidade de IPA, 10 correspondendo a quase certa IPA) em vista do curso clínico completo da doença.

Variáveis ​​adicionais e fontes de dados: Para todos os pacientes da coorte, as informações epidemiológicas e clínicas serão extraídas do sistema de registros médicos eletrônicos (EMR) do hospital usado em nosso hospital recuperado com a ajuda do software MD-clone. Precisamos obter as informações pessoais dos pacientes para acessar seus dados registrados no acompanhamento diário em seu prontuário, pois alguns dados não são codificados. Todos os dados serão posteriormente codificados e retirados quaisquer identificadores pessoais, incluindo nome, sobrenome, data de nascimento, número de identificação e endereço. Todos os dados devem ser armazenados em um disco rígido designado nas mãos do investigador principal. As fontes de dados incluirão o arquivo do paciente no registro EMR "prometheus", bem como os dados recuperados usando o software MD-clone. Os dados coletados incluirão: dados demográficos (idade, sexo), diagnósticos anteriores, tempo de permanência e transferência para outras unidades, resultados laboratoriais, sinais vitais registrados e o método de oxigenação usado conforme documentado no acompanhamento diário.

Cronograma de coleta de amostra: A primeira amostra de pacientes consentidos incluídos neste estudo será coletada dentro de 7 dias a partir da TC de tórax inicial. Posteriormente, após qualquer suspeita clínica de API pelo médico assistente - uma suspeita que invariavelmente leva à realização de uma TC de tórax, as amostras serão coletadas em até 7 dias a partir da TC de tórax. Amostras adicionais serão coletadas dentro de 7 dias a partir da descontinuação do tratamento antifúngico pelo médico assistente. O cronograma de amostragem, são visualizados na figura 1.

Figura 1 - Estratégia de amostragem. A intervenção deste estudo é limitada à amostragem sublinhada em negrito vermelho - todas as outras etapas fazem parte do manejo usual de pacientes com LMA e não são de forma alguma afetadas pela participação neste estudo. LMA - Leucemia Mielóide Aguda; Dx - Diagnóstico; TC - Tomografia Computadorizada; API - Aspergilose Pulmonar Invasiva; Tx - Tratamento; d/c - descontinuado; GGO - Opacidades em vidro fosco.

Tratamento de dados e análise estatística:

Os dados clínicos devem ser analisados ​​por meio de estatísticas descritivas, testes paramétricos e não paramétricos, conforme apropriado. Todas as análises estatísticas devem ser realizadas usando o software R versão 4.0.0 ("Dia da Árvore") ou posterior. Todos os dados identificáveis, incluindo as características basais do paciente, resultados laboratoriais e de imagem e diagnósticos anteriores e registros de tratamento, devem ser armazenados pelo investigador principal em um dispositivo de memória de fase sólida criptografado RAS designado durante o estudo. Os nomes dos pacientes, números de identificação, endereço e data de nascimento não serão armazenados.

Os resultados da espectroscopia de massa serão revisados ​​usando a estação de trabalho e o software MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). A análise de discriminação de mínimos quadrados parciais será realizada usando o software SIMCA versão 14.0 ou posterior (MKS Umetrics, Suécia). Para cada faixa de m/z será construído um modelo de regressão logística, permitindo o cálculo da importância da variável para projeção (VIP). Para todos os VIPs ≥1, o perfil iônico correspondente será selecionado como alvo potencial. Estes serão comparados com metabólitos previamente implicados indicativos de IPA, (10,11) bem como com nosso banco de dados existente, conforme resumido no APÊNDICE A. Essa identificação é crucial, pois o mesmo valor de m/z pode corresponder a diferentes metabólitos, como diferentes substâncias podem ter a mesma taxa de carga de germoplasma. Em seguida, todas as substâncias identificadas serão confirmadas contra o Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) 11 Mass Spectral Library (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) e um padrão químico puro. Finalmente, a matriz digital composta pelos VOCs característicos selecionados será importada para python (versão 3.10.5 ou posterior) para construir diferentes modelos de classificação, com desempenhos preditivos avaliados por regressão logística binária. As correlações entre os níveis de expressão de COV no ar exalado e os níveis séricos e BAL de d-galactomanana e certeza diagnóstica de IPA (confirmada, provável ou possível, conforme definido abaixo) serão realizadas usando o r de Person.

Tamanho e poder da amostra:

Neste estudo longitudinal prospectivo, pacientes com alta probabilidade de desenvolver IPA (isto é, pacientes diagnosticados com leucemia aguda) serão incluídos no momento do diagnóstico. Uma vez que nosso centro realiza triagem de TC de tórax inicial para identificar potencial IPA no início do estudo, VOC coletado após radiografia normal pode servir como amplo controle. Pelo menos 15% desses pacientes desenvolvem API nos meses seguintes,(3) limitando o tamanho da amostra necessária no recrutamento. Com base na adesão ao acompanhamento relatada anteriormente,(12) esperamos que a taxa de desistência seja baixa, permitindo a detecção de alterações pós-tratamento anteriormente indescritíveis nos perfis de VOC.

Para fins desses cálculos, assumimos a sensibilidade dos ensaios VOC relatados anteriormente (em comparação com microbiologia ou teste de antígeno em secreções respiratórias, BAL ou soro do paciente) de 80-95% cada.(10) Pesquisas retrospectivas recentes identificaram a incidência de API em 5% na triagem inicial de TC e mais 10% na hospitalização inicial.(3) Isso se traduz em um tamanho amostral estimado de 124 pacientes, calculado sob a suposição de significância aceita (alfa = 0,05) e poder (beta = 0,8). Permitindo uma inscrição estimada de 70% e a taxa de exclusão adicional de 15%, o tamanho total estimado da amostra é de 208 pacientes. Projetando a incidência média anual de 90 novos casos de leucemia aguda tratados em nosso hospital, essa meta de amostragem deve ser facilmente alcançada dentro do período de recrutamento pré-especificado de 30 meses. Assim, esperamos que o número de participantes seja de 300.

CONSIDERAÇÕES ÉTICAS O desenvolvimento e aprimoramento de técnicas não invasivas para identificação da IPA tem sido o objetivo declarado de várias sociedades profissionais por mais de duas décadas. (1,4) A ferramenta de diagnóstico proposta pelos pacientes traz o mínimo ou nenhum inconveniente para os participantes, e consideramos os possíveis efeitos colaterais e perigos insignificantes nesta modalidade totalmente não invasiva.

Após a extração de dados, todos os dados serão despojados de qualquer identificação, incluindo nome, sobrenome, número de identificação, número do processo, data de nascimento e endereço - todos destruídos quando a extração inicial de dados for concluída. Os dados devem ser armazenados de forma segura em um dispositivo SD designado criptografado por RAS nas mãos do PI, minimizando a probabilidade deste estudo afetar a privacidade dos dados ou a confidencialidade médica dos pacientes incluídos. Tendo em vista o efeito direto que os resultados desta investigação podem ter sobre a gestão e o prognóstico dos doentes graves, achamos que os benefícios deste estudo superam quaisquer riscos potenciais.

Financiamento Nenhum financiamento externo foi fornecido para este estudo até agora.

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