ЛОС в образцах дыхания для диагностики ИАЛ

ПРЕДПОСЫЛКИ Диагноз инвазивного аспергиллеза легких (IPA) имеет серьезные последствия для прогноза и плана лечения пациента с иммуносупрессией. Вездесущность Aspergillus spp. в окружающей среде и, как следствие, повсеместное распространение таких изолятов в дыхательной системе здоровых людей представляет собой серьезную диагностическую проблему. А именно, дифференциация IPA от неинвазивной колонизации дыхательных путей может быть сложной задачей. Эта дилемма усугубляется огромным увеличением распространенности пациентов с иммуносупрессией, включая онкологические заболевания и лечение онкологических заболеваний, гемопоэтические стволовые клетки и трансплантацию паренхиматозных органов, а также иммуномодулирующие препараты. (1) В частности, пациенты с острым миелогенным лейкозом (ОМЛ) подвержены высокому риску развития ИАЛ, причем у 5-15% таких пациентов ИЛА развивается в течение первых 3 месяцев после постановки диагноза ОМЛ (1-3). Поскольку до 5% пациентов с ОМЛ могут иметь ИАЛ при поступлении, пациенты, поступившие в Медицинский центр Рамбам (РМЦ) с новым диагнозом ОМЛ, регулярно проходят компьютерную томографию (КТ) органов грудной клетки, которая служит скринингом на наличие ИАЛ при постановке диагноза. и исходный уровень для дальнейших справок, если позже возникнет подозрение на ИАЛ. (3) Диагностика вероятного или доказанного ИАЛ у пациента с ОМЛ требует наводящих на размышления результатов визуализации наряду с микробиологическими данными. Хотя в некоторых случаях диагноз можно поставить с помощью биомаркеров (в основном, d-галактоманнанового антигена и/или полимеразной цепной реакции Aspergillus spp) в периферической крови, чувствительность этих анализов низка, и часто этот минимально инвазивный подход не дает достаточной диагностической достоверности. В таких случаях обычно проводят бронхоскопию с бронхоальвеолярным лаважем. Эта инвазивная процедура особенно опасна для пациентов с подозрением на ИАЛ, подавляющее большинство из которых очень слабы из-за основного заболевания (4). Эти соображения привели к поиску дополнительных неинвазивных методов диагностики ИАЛ. (5) Одним из таких подходов является анализ летучих органических соединений (ЛОС) в пробах выдыхаемого воздуха. Анализ профиля ЛОС в выдыхаемом воздухе, характеризующийся низким давлением паров при комнатной температуре, представляет собой новую область диагностики с потенциалом неинвазивного скрининга и диагностики различных заболеваний, включая новообразования (6), инфекции (7) и воспалительные процессы. (8) Предыдущие исследования выявили потенциальные маркеры ЛОС метаболически активного вида Aspergillus (9), а одно небольшое проспективное исследование на людях (10) продемонстрировало обнадеживающую диагностическую эффективность идентификации IPA на основе ЛОС. Однако эти попытки были затруднены несколькими ловушками. Во-первых, профили ЛОС in vitro Aspergillus spp, по-видимому, мало связаны с ЛОС, обнаруженными при анализе дыхания колонизированных пациентов. (5) Во-вторых, выдыхаемые ЛОС, как правило, сильно различаются у разных людей, что делает важным предостережение об отсутствии временного контроля (т. е. изменения профиля ЛОС у одного и того же человека до и после развития IPA) (10). В-третьих, насколько нам известно, никакие лонгитюдные исследования не оценивали реакцию профилей ЛОС на обработку ИПС.

В этом проспективном лонгитюдном исследовании мы стремимся преодолеть эти препятствия, используя две ключевые характеристики гематологических пациентов, получающих лечение в RMC. Во-первых, пациенты с впервые диагностированным ОМЛ имеют относительно высокую распространенность ИАЛ. Во-вторых, КТ органов грудной клетки проводится при диагностике ОМЛ у всех пациентов. Таким образом, сбор образцов дыхания у пациентов с нормальным исходным уровнем КТ будет служить отрицательным контролем, что позволит сравнить профили ЛОС до и после развития ИАЛ у одного и того же пациента. Дальнейший отбор проб после выздоровления пациента от ПНД обеспечит дополнительный продольный контроль.

ЦЕЛИ Идентификация профилей летучих органических соединений, предсказывающих ИФА в образцах выдыхаемого воздуха.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования:

Это одноцентровое нерандомизированное проспективное когортное исследование. Образцы дыхания пациентов, давших согласие, будут проанализированы на профили летучих органических соединений во время первоначального КТ-скрининга на IPA. Кроме того, образцы также будут собираться во время диагностики любого возможного, вероятного или подтвержденного ИАЛ (определяемого в соответствии с критериями EORTC (4), как подробно описано ниже).

Сеттинг и участники:

Пациенты с впервые диагностированным ОМЛ, начавшие лечение в гематологическом отделении РМЦ, будут сближены. Период включения будет с 1 октября 2022 года по 31 марта 2025 года.

Критерии включения:

Новый диагноз острого миелоидного лейкоза И/ИЛИ плановая трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (HCT) КТ органов грудной клетки, выполненная в течение 30 дней с момента взятия проб Возраст 18 лет и старше Возможность предоставления образцов придыхательного дыхания общим объемом 10 л непосредственно в мешок Тедлара

Критерий исключения:

Любое состояние, нарушающее способность пациента дать информированное согласие

Сбор образцов:

Образцы дыхания будут собираться в одной из 23 специализированных палат госпитализации нашего гематологического отделения - с положительным давлением и климат-контролем с высокоэффективными фильтрами для твердых частиц E-pure (HEPA) (ADS-Laminaire, Израиль). Пациенты должны будут воздерживаться от чистки зубов, полоскания рта, еды, питья или курения в течение 6 часов до сбора образцов. После 10-минутного сидения (во избежание повышения концентрации изопрена, вызванного физическими упражнениями (11)), пациента попросят заполнить 10 л дыхательных путей в мешок из тедлара (SKC, Южная Корея). Одновременно идентичный мешочек из тедлара должен быть заполнен окружающим воздухом.

После каждого отбора проб будут регистрироваться следующие данные:

Характеристики пациента, включая возраст, онкогематологический диагноз, время от первоначального диагноза, текущее лечение, время от ТГСК, если применимо, фоновые диагнозы. Текущее фармакологическое лечение, включая все антибиотики и противогрибковые препараты, назначенные в предыдущем месяце.

Текущие диагностические тесты, включая все культуры, серологические анализы, исследования амплификации нуклеиновых кислот, общий анализ крови и биохимию, уровень вориконазола в плазме и визуализацию органов грудной клетки, выполненные в течение последнего месяца.

Работа с пробами и извлечение ЛОС:

Все мешки из тедлара будут храниться при температуре 4 ℃ после сбора. Адсорбцию в две параллельные термодесорбционные трубки следует проводить с помощью индивидуального насоса для отбора проб воздуха с малым расходом Gilian LFS-113 (SRA Instruments, Милан, Италия) в течение 72 часов с момента отбора проб и хранить в условиях окружающей среды. Эти образцы будут промаркированы (закодированы) и переданы в лабораторию химии окружающей среды (Институт химии Касали, Еврейский университет в Иерусалиме, Израиль).

Аналитика:

Термическую десорбцию проводят при 290°С в течение 20 минут с использованием аналитического чистого (99,999%) газообразного гелия в качестве носителя. Ввод в тандемную газовую хроматографию и масс-спектроскопию (ГХ-МС) должен выполняться при аналогичных входных температурах, не превышающих расход 40 мл/мин. Начальная температурная программа ГХ будет имитировать ранее описанные (10) протоколы: 40°C в течение 3 минут, повышение до 70°C со скоростью 5°C в минуту и ​​выдержка в течение 3 минут, повышение до 203°C при 7°C. в минуту и ​​выдерживали 4 минуты, быстро повышали до 270°С и выдерживали 5 минут. Тройной счетверенный масс-спектрометр (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) должен быть подключен в тандеме с диапазоном измерения массы 20–400 м/з.

Диагноз инвазивного легочного аспергиллеза будет определяться в соответствии с обновленными критериями EORTC (4) как одно из следующего:

Подтвержденный IPA определяется как образец респираторной биопсии с положительной культурой Aspergillus spp или гистопатологической демонстрацией инвазии ткани гифами.

«Вероятная ИАЛ», определяемая (1) как совместимые рентгенографические признаки на КТ органов грудной клетки (плотные, хорошо очерченные очаги с гало-симптомом или без него, знак «воздушный полумесяц» или полость) и любое из следующего: Признаки аспергиллеза spp при цитологическом исследовании, прямой микроскопии или посеве из любого респираторного образца, включая мокроту, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) или бронхиальную щетку. Положительный антиген D-галактоманнана, обнаруженный в плазме, сыворотке или жидкости БАЛ. Положительная полимеразная цепная реакция (ПЦР) на Aspergillus spp, обнаруженный в плазме, сыворотке или жидкости БАЛ «Возможный ИАЛ», определяемый (1) как совместимые рентгенографические признаки на КТ грудной клетки (плотные, хорошо очерченные очаги с или без знака ореола, знака воздушной полумесяца или полости ) без подтверждающих лабораторных данных.

Дополнительная информация о вероятности диагноза ИАЛ будет собираться двумя независимыми наблюдателями (И.Г. и А.С.), которые просматривают полную электронную медицинскую карту (ЭМК) в конце периода исследования, присваивая единую оценку вероятности от 1 до 10 (1 – очень низкая вероятность ИАЛ, 10 соответствует почти достоверному ИФА) с учетом полного клинического течения болезни.

Дополнительные переменные и источники данных. Для всех когортных пациентов эпидемиологическая и клиническая информация будет извлечена из системы электронных медицинских карт (EMR), используемой в нашей больнице, полученной с помощью программного обеспечения MD-clone. Нам потребуется получить личную информацию пациентов, чтобы получить доступ к их данным, записанным в ежедневных наблюдениях в их медицинской карте, поскольку некоторые данные не закодированы. Все данные должны быть позже закодированы и удалены любые личные идентификаторы, включая имя, фамилию, дату рождения, идентификационный номер и адрес. Все данные должны храниться на специально отведенном жестком диске в руках главного исследователя. Источники данных будут включать файл пациента в реестре EMR «prometheus», а также данные, полученные с помощью программного обеспечения MD-clone. Собранные данные будут включать: демографические данные (возраст, пол), фоновые диагнозы, продолжительность пребывания и перевода в другие отделения, результаты лабораторных исследований, зарегистрированные показатели жизнедеятельности и используемый метод оксигенации, документально подтвержденный при ежедневном наблюдении.

График сбора образцов: первый образец добровольных пациентов, включенных в это исследование, будет собран в течение 7 дней после исходной КТ грудной клетки. Впоследствии, после любого клинического подозрения лечащего врача на ИАЛ - подозрение, которое неизменно приводит к выполнению КТ грудной клетки, образцы будут взяты в течение 7 дней после КТ грудной клетки. Дополнительные образцы будут взяты в течение 7 дней после прекращения противогрибкового лечения лечащим врачом. График отбора проб представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 – Стратегия выборки. Вмешательство в этом исследовании ограничено отбором проб, выделенным жирным красным цветом — все остальные этапы являются частью обычного ведения пациентов с ОМЛ и никоим образом не затрагиваются участием в этом исследовании. ОМЛ - острый миелоидный лейкоз; Дх - диагностика; КТ - компьютерная томография; ИЛА - инвазивный легочный аспергиллез; Тх - лечение; д/к - снято с производства; GGO - Непрозрачность матового стекла.

Обработка данных и статистический анализ:

Клинические данные должны быть проанализированы с использованием описательной статистики, параметрических и непараметрических тестов по мере необходимости. Весь статистический анализ должен выполняться с использованием программного обеспечения R версии 4.0.0 («День беседки») или более поздней версии. Все идентифицируемые данные, включая исходные характеристики пациента, результаты лабораторных исследований и визуализации, а также предыдущие диагнозы и записи о лечении, должны храниться основным исследователем на специальном твердофазном запоминающем устройстве с шифрованием RAS на протяжении всего исследования. Имена пациентов, идентификационные номера, адрес и дата рождения не сохраняются.

Результаты масс-спектроскопии будут рассмотрены с использованием рабочей станции и программного обеспечения MassHunter (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). Частичный анализ дискриминации методом наименьших квадратов будет выполняться с использованием программного обеспечения SIMCA версии 14.0 или более поздней (MKS Umetrics, Швеция). Для каждого диапазона m/z будет построена модель логистической регрессии, позволяющая рассчитать важность переменной для прогноза (VIP). Для всех VIP ≥1 соответствующий ионный профиль будет выбран в качестве потенциальной мишени. Они будут сравниваться с ранее выявленными метаболитами, указывающими на IPA (10,11), а также с нашей существующей базой данных, как указано в ПРИЛОЖЕНИИ A. Такая идентификация имеет решающее значение, поскольку одно и то же значение m/z может соответствовать разным метаболитам, поскольку разные вещества могут иметь одинаковый коэффициент заряда зародышевой плазмы. Затем все идентифицированные вещества будут проверены по Масс-спектральной библиотеке Национального института стандартов и технологий (NIST) 11 (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) и чистому химическому стандарту. Наконец, цифровая матрица, состоящая из выбранных характеристических ЛОС, будет импортирована в Python (версия 3.10.5 или более поздняя) для построения различных моделей классификации с прогностическими характеристиками, оцениваемыми с помощью бинарной логистической регрессии. Корреляции между уровнями экспрессии ЛОС в выдыхаемом воздухе и уровнями d-галлактоманнана в сыворотке и БАЛ и диагностической достоверностью IPA (подтвержденной, вероятной или возможной, как определено ниже) будут выполняться с использованием r человека.

Размер образца и мощность:

В это проспективное лонгитюдное исследование будут включены пациенты с высокой вероятностью развития ИАЛ (т. е. пациенты с диагнозом острый лейкоз) при постановке диагноза. Поскольку наш центр выполняет базовый скрининг КТ органов грудной клетки для выявления потенциального IPA на исходном уровне, ЛОС, собранные после обычной рентгенографии, могут служить достаточным контролем. По крайней мере, у 15% таких пациентов в последующие месяцы развивается ИАЛ (3), что ограничивает размер выборки, необходимый при наборе. Основываясь на предыдущих сообщениях о приверженности к последующему наблюдению (12), мы ожидаем, что показатель отсева будет низким, что позволит выявить ранее неуловимые изменения профилей ЛОС после лечения.

Для целей этих расчетов мы предположили, что чувствительность анализов ЛОС, о которых сообщалось ранее (по сравнению с микробиологическими исследованиями или тестами на антигены в выделениях из дыхательных путей, БАЛ или сыворотке пациентов), составляет 80-95% каждый. (10) Недавние ретроспективные исследования показали, что частота ИАЛ составляет 5 % при начальной скрининговой КТ и еще 10 % при первичной госпитализации (3). Это соответствует расчетному размеру выборки в 124 пациента, рассчитанному в предположении о принятой значимости (альфа = 0,05) и мощности (бета = 0,8). С учетом предполагаемого 70% включения и дополнительных 15% исключения, общий расчетный размер выборки составляет 208 пациентов. Прогнозируя среднегодовую заболеваемость 90 новых случаев острого лейкоза, пролеченных в нашей больнице, эта цель выборки должна быть легко достигнута в течение заранее установленного 30-месячного периода набора. Таким образом, мы ожидаем, что количество участников составит 300 человек.

ЭТИЧЕСКИЕ СООБРАЖЕНИЯ Разработка и совершенствование неинвазивных методов идентификации IPA является заявленной целью различных профессиональных обществ на протяжении более двух десятилетий. (1,4) Предложенный пациентами диагностический инструмент доставляет минимальное неудобство участникам, и мы считаем потенциальные побочные эффекты и опасность незначительными в этом полностью неинвазивном методе.

После извлечения данных все данные должны быть лишены какой-либо идентификации, включая имя, фамилию, идентификационный номер, номер дела, дату рождения и адрес — все они уничтожаются после завершения первоначального извлечения данных. Данные должны храниться в безопасном месте на зашифрованном RAS, указанном устройстве SD, находящемся в руках PI, что сводит к минимуму вероятность того, что это исследование повлияет на конфиденциальность данных или медицинскую конфиденциальность включенных пациентов. Ввиду прямого влияния результатов этого исследования на лечение и прогноз тяжелобольных, мы считаем, что преимущества этого исследования перевешивают любые потенциальные риски.

Финансирование Внешнее финансирование данного исследования до сих пор не предоставлялось.

Библиография

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele AM, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. Клинический алгоритм диагностики инвазивного аспергиллеза легких у пациентов в критическом состоянии. Am J Respir Crit Care Med. 2012 1 июля; 186 (1): 56-64.
2. Соуза Л., Нуэр С.А., Моралес Х., Симойнс Б., Солза С., Кейроз-Теллес Ф. и др. Эпидемиология инвазивных грибковых заболеваний у гематологических больных. Микозы. 2021 март; 64 (3): 252-6.
3. Биттерман Р., Хардак Э., Рейнс М., Стерн А., Цукерман Т., Офран Ю. и др. Базовая компьютерная томография органов грудной клетки для ранней диагностики инвазивного легочного аспергиллеза у гематоонкологических пациентов: проспективное когортное исследование. Клин Инфекция Дис. 2019 30 октября; 69 (10): 1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et al. Пересмотр и обновление согласованных определений инвазивных грибковых заболеваний от европейской организации по исследованию и лечению рака и консорциума по изучению и исследованию микозов. Клин Инфекция Дис. 2020 12 сентября; 71 (6): 1367-76.
5. Савельев М.Г., Паппалардо Л. Новые передовые методы диагностики аспергиллеза на основе метаболитов. PLoS Патог. 7 сентября 2017 г .; 13 (9): e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang HC, Chang C-J, Liang S-K и др. Изучение летучих органических соединений в выдыхаемом воздухе для высокоточного прогнозирования рака легких. Раков (Базель). 2021 21 марта; 13 (6).
7. Камаль Ф., Кумар С., Эдвардс М.Р., Веселков К., Беллуомо И., Кебадзе Т. и др. Вызванные вирусом летучие органические соединения обнаруживаются в выдыхаемом воздухе при легочной инфекции. Am J Respir Crit Care Med. 2021 1 ноября; 204 (9): 1075-85.
8. Кастро-Родригес Дж.А., Сифуэнтес Л., Мартинес Ф.Д. Прогнозирование астмы по клиническим показателям. Фронт Педиатр. 2019 июль 31;7:320.
9. Дас С., Пал М. Обзор - Неинвазивный мониторинг здоровья человека с помощью анализа выдыхаемого воздуха: всесторонний обзор. J Электрохим Soc. 2020 3 февраля; 167 (3): 037562.
10. Ку С., Томас Х.Р., Дэниэлс С.Д., Линч Р.К., Фортиер С.М., Ши М.М. и др. Сигнатура вторичного метаболита дыхательного грибка для диагностики инвазивного аспергиллеза. Клин Инфекция Дис. 2014 15 декабря; 59 (12): 1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y и др. Выдыхаемые летучие органические соединения для выявления больных хроническим аспергиллезом легких. Front Med (Лозанна). 2021, 23 сентября; 8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Диагностическая роль полимеразной цепной реакции в жидкости бронхоальвеолярного лаважа для инвазивного легочного аспергиллеза у пациентов с ослабленным иммунитетом - ретроспективное когортное исследование. Int J Infect Dis. 2019 июнь;83:20-5.