VOC i andningsprov för diagnos av IPA

BAKGRUND Diagnosen invasiv pulmonell aspergillos (IPA) har allvarliga konsekvenser för den immunsupprimerade patientens prognos och behandlingsplan. Närvaron av Aspergillus spp i miljön, och i förlängningen - förekomsten av sådana isolat i friska försökspersoners andningsorgan, utgör en stor diagnostisk utmaning. Nämligen kan differentieringen av IPA från icke-invasiv kolonisering av luftvägarna vara utmanande. Den enorma ökningen av prevalensen av patienter som är immunsupprimerade, inklusive maligniteter och onkologiska behandlingar, hematopoetiska stamceller och solida organtransplantationer och immunmodulerande mediciner, accentuerar detta dilemma.(1) Speciellt patienter med akut myelogen leukemi (AML) löper hög risk att utveckla IPA, med 5-15% av dessa patienter som utvecklar IPA under de första 3 månaderna efter AML-diagnosen.(1-3) Eftersom upp till 5 % av patienterna med AML kan ha IPA vid presentationen genomgår patienter som tas in på Rambam Medical Center (RMC) med en ny diagnos av AML rutinmässigt en datortomografi (CT), som fungerar som screening för förekomsten av IPA vid diagnos och en baslinje för ytterligare referens om IPA misstänks senare.(3) Diagnos av trolig eller bevisad IPA hos en AML-patient kräver suggestiva avbildningsfynd tillsammans med mikrobiologiska bevis. Även om diagnosen i vissa fall kan ställas med hjälp av biomarkörer (främst d-galaktomannan-antigenet och eller Aspergillus spp-polymeraskedjereaktion) i perifert blod, är känsligheten för dessa analyser låg och ofta ger denna minimalt invasiva metod inte tillräcklig diagnostisk säkerhet. I sådana fall utförs vanligtvis bronkoskopi med bronkoalveolär sköljning. Denna invasiva procedur är särskilt farlig för patienter med misstänkt IPA, av vilka de allra flesta är mycket svaga på grund av sin underliggande sjukdom.(4) Dessa överväganden har lett sökandet efter ytterligare, icke-invasiva modaliteter vid diagnos av IPA. (5) En sådan metod har varit analys av flyktiga organiska föreningar (VOC) i utandningsluftprover. Karaktäriserad av lågt ångtryck vid rumstemperatur, är VOC-profilanalys av utandningsluft ett framväxande område för diagnostik, med potential för icke-invasiv screening och diagnos av olika sjukdomar, inklusive neoplasmer,(6) infektioner(7) och inflammatoriska processer. (8) Tidigare studier har identifierat potentiella VOC-markörer för metaboliskt aktiva Aspergillus spp,(9) med en liten prospektiv studie på människor(10) som visar uppmuntrande diagnostisk prestanda för VOC-baserad IPA-identifiering. Dessa försök har dock försvårats av flera fallgropar. För det första verkar VOC-profiler för Aspergillus spp in vitro ha litet samband med VOC som hittats i utandningsanalys av koloniserade patienter.(5) För det andra tenderar utandade VOC att skilja sig mycket mellan individer, vilket gör frånvaron av tidskontroller (dvs. VOC-profilförändringar hos samma individ före och efter IPA-utveckling) till en avgörande varning.(10) För det tredje har såvitt vi vet inga longitudinella studier bedömt svaret av VOC-profiler på IPA-behandling.

I denna prospektiva longitudinella studie syftar vi till att övervinna dessa hinder genom att dra fördel av två nyckelegenskaper hos hematologiska patienter som behandlas i RMC. För det första har patienter med nydiagnostiserad AML en relativt hög prevalens av IPA. För det andra utförs en bröst-CT vid diagnosen AML hos alla patienter. Således kommer insamling av utandningsprover från patienter med normal baslinje-CT att fungera som negativa kontroller, vilket möjliggör jämförelse av VOC-profiler före och efter utvecklingen av IPA hos samma patient. Ytterligare provtagning efter att patienten har återhämtat sig från IPA kommer att ge ytterligare longitudinell kontroll.

MÅL Identifiering av VOC-profiler som förutsäger IPA i utandningsprover

METODER

Studera design:

Detta är en prospektiv kohortstudie med ett enda centrum, icke randomiserat. Andningsprover från samtyckande patienter kommer att analyseras för VOC-profiler vid tidpunkten för den första CT-screeningen för IPA. Dessutom kommer prover också att samlas in vid tidpunkten för diagnos av eventuell, trolig eller bekräftad IPA (definierad enligt EORTC-kriterierna (4) enligt nedan).

Inställning och deltagare:

Patienter som nyligen diagnostiserats med AML som påbörjar behandling på RMC hematologiska avdelning kommer att kontaktas. Inklusionsperioden kommer att vara från 1 oktober 2022 till 31 mars 2025.

Inklusionskriterier:

Ny diagnos av akut myeloid leukemi OCH/ELLER planerad hematopoetisk stamcellstransplantation (HCT) Bröst-CT utförd inom 30 dagar från provtagning 18 års ålder eller äldre Förmågan att ge tidvattenandningsprover på totalt 10L direkt i en Tedlar-påse

Exklusions kriterier:

Alla tillstånd som försämrar patientens förmåga att ge informerat samtycke

Provsamling:

Andningsprover kommer att samlas in i en av vår hematologiska avdelnings 23 dedikerade sjukhusinläggningsrum - positivt trycksatt och klimatkontrollerat med E-pure högeffektiva partikelluftfilter (HEPA) (ADS-Laminaire, Israel). Patienterna kommer att behöva avstå från tandborstning, tandtvätt, att äta, dricka eller röka under 6 timmar före provtagning. Efter att ha suttit i 10 minuter (för att undvika träningsinducerad ökning av isoprenkoncentrationen (11) ), kommer patienten att uppmanas att fylla 10L tidvattenandning i en tedlarpåse (SKC, Sydkorea). Samtidigt ska en identisk tedlarpåse fyllas med omgivande luft.

Vid varje provinsamling kommer följande data att registreras:

Patientens egenskaper, inklusive ålder, hemato-onkologisk diagnos, tid från initial diagnos, aktuell behandling, tid från HCT om tillämpligt, bakgrundsdiagnoser Aktuell farmakologisk behandling, inklusive alla antibiotika och antimykotika som ordinerats föregående månad.

Aktuella diagnostiska tester, inklusive alla odlingar, serologiska analyser, nukleinsyraamplifieringsstudier, fullständigt blodvärde och kemi, plasmanivåer av vorikonazol och avbildning av bröstkorgen utförda under den senaste månaden.

Provhantering och VOC-extraktion:

Alla tedlarpåsar kommer att förvaras vid 4℃ efter insamling. Adsorption på 2 parallella termiska desorptionsrör ska utföras via Gilian LFS-113 lågflödes personlig luftprovtagningspump (SRA instrument, Milano, Italien), utförd inom 72 timmar från provtagning och lagrad under omgivande förhållanden. Dessa prover kommer att märkas (kodas) och omvandlas till Environmental Chemistry Laboratory (Kasali Institute of Chemistry, Hebrew University of Jerusalem, Israel)

Analytics:

Termisk desorption kommer att utföras vid 290°C under 20 minuter med användning av heliumgas av analytisk kvalitet (99,999 %) som bärare. Injektion till tandemgaskromatografimasspektroskopi (GC-MS) ska utföras vid liknande inloppstemperaturer som inte överstiger flödet på 40 ml/min. Det initiala GC-temperaturprogrammet kommer att efterlikna tidigare rapporterade (10) protokoll: 40˚C i 3 minuter, höjt till 70˚C med en hastighet av 5˚C per minut och hålls i 3 minuter, höjt till 203˚C vid 7˚C per minut och hölls i 4 minuter, höjdes snabbt till 270˚C och hölls i 5 minuter. En trippel quad masspektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ska anslutas i tandem, med ett massmätningsområde på 20-400 m/z.

Diagnosen invasiv pulmonell aspergillos kommer att definieras enligt de uppdaterade EORTC-kriterierna (4) som något av följande:

Bekräftad IPA definierad som ett respiratoriskt biopsiprov med positiv odling av Aspergillus spp eller histopatologisk demonstration av vävnadsinvasion av hyfer.

"Sannolik IPA", definierad (1) som kompatibla radiografiska kännetecken på bröst-CT (Täta, väl omskrivna lesioner med eller utan ett halo-tecken, luft-halvmåne-tecken eller en hålighet) och något av följande: Bevis för Aspergillus spp efter cytologi, direktmikroskopi eller odling från något andningsprov, inklusive sputum, bronko-alveolär sköljvätska (BAL) eller bronkialborste Positivt D-galaktomannanantigen detekterat i plasma, serum eller BAL-vätska Positiv polymeraskedjereaktion (PCR) för Aspergillus spp detekterad i plasma, serum eller BAL-vätska "Möjlig IPA", definierad (1) som kompatibla radiografiska kännetecken på bröst-CT (Täta, väl omskrivna lesioner med eller utan halo-tecken, luft-halvmåne-tecken eller en hålighet ) utan bekräftande laboratoriefynd.

Ytterligare information om sannolikheten för IPA-diagnos kommer att samlas in av två oberoende observatörer (I.G. och A.S.) som granskar den fullständiga elektroniska medicinska journalen (EMR) i slutet av studieperioden, och tilldelar ett enda sannolikhetspoäng 1-10 (1 är mycket lågt sannolikheten för IPA, 10 motsvarande nästan säker IPA) med tanke på sjukdomens fullständiga kliniska förlopp.

Ytterligare variabler och datakällor: För alla kohortpatienter kommer epidemiologisk och klinisk information att extraheras från sjukhusets elektroniska journalsystem (EMR) som används på vårt sjukhus hämtat med hjälp av MD-clone-mjukvaran. Vi kommer att behöva skaffa personlig information om patienter för att få tillgång till deras data som registreras i den dagliga uppföljningen i deras medicinska diagram eftersom vissa uppgifter inte är kodade. All data ska senare kodas och tas bort från alla personliga identifierare inklusive namn, efternamn, födelsedatum, ID-nummer och adress. All data ska lagras på en avsedd hårddisk i händerna av den primära utredaren. Datakällor kommer att inkludera patientens fil på "prometheus" EMR-registret såväl som hämtade data med hjälp av MD-klonprogramvara. Insamlade data kommer att omfatta: demografi (ålder, kön), bakgrundsdiagnoser, vistelsetid och överföring till andra enheter, laboratorieresultat, registrerade vitala tecken och syresättningsmetoden som används enligt den dagliga uppföljningen.

Provtagningsschema: Det första provet av samtyckande patienter som ingår i denna studie kommer att samlas in inom 7 dagar från baslinje-CT-thorax. Därefter, efter varje klinisk misstanke om IPA av den behandlande läkaren - en misstanke som alltid leder till att en bröst-CT utförs, kommer prover att samlas in inom 7 dagar från bröst-CT. Ytterligare prover kommer att samlas in inom 7 dagar efter att den behandlande läkaren avbrutit antimykotikabehandlingen. Provtagningsschemat är visualiserat i figur 1.

Figur 1 - Provtagningsstrategi. Denna studies intervention är begränsad till provtagning understruken i fet rött - alla andra steg är en del av den vanliga behandlingen av AML-patienter och påverkas inte på något sätt av deltagandet i denna studie. AML - Akut Myeloid Leukemi; Dx - Diagnos; CT - Datortomografi; IPA - Invasiv pulmonell aspergillos; Tx - Behandling; d/c - avvecklad; GGO - Ground Glass Opacities.

Datahantering och statistisk analys:

Kliniska data ska analyseras med hjälp av beskrivande statistik, parametriska och icke-parametriska tester efter behov. All statistisk analys ska utföras med R mjukvaruversion 4.0.0 ("Arbor day") eller senare. Alla identifierbara data, inklusive patientens baslinjeegenskaper, laboratorie- och bildresultat och tidigare diagnoser och behandlingsjournaler, ska lagras av den primära prövaren på en utsedd RAS-krypterad fastfasminnesenhet under hela studien. Patientens namn, ID-nummer, adress och födelsedatum kommer inte att lagras.

Massspektroskopi utdata kommer att granskas med hjälp av MassHunter arbetsstation och programvara (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Partiell minsta kvadraters diskrimineringsanalys kommer att utföras med SIMCA-programvaruversion 14.0 eller senare (MKS Umetrics, Sverige). För varje m/z-intervall kommer en logistisk regressionsmodell att konstrueras, vilket möjliggör beräkning av variabelns betydelse för projektion (VIP). För alla VIPs ≥1 kommer motsvarande jonprofil att väljas som ett potentiellt mål. Dessa kommer att jämföras med tidigare implicerade metaboliter som tyder på IPA, (10,11) samt vår befintliga databas, som sammanfattas i APPENDIX A. Sådan identifiering är avgörande eftersom samma m/z-värde kan motsvara olika metaboliter, som olika substanser kan ha samma könsplasmaladdningsförhållande. Därefter kommer alla identifierade ämnen att bekräftas mot National Institute of Standards and Technology (NIST) 11 Mass Spectral Library (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) och en ren kemisk standard. Slutligen kommer den digitala matrisen som består av de valda karakteristiska VOC:erna att importeras till python (version 3.10.5 eller senare) för att konstruera olika klassificeringsmodeller, med prediktiva prestanda bedömda genom binär logistisk regression. Korrelationerna mellan VOC-expressionsnivåer i utandningsluft och nivåer av serum och BAL-d-gallaktomannan och IPA-diagnostisk säkerhet (bekräftad, trolig eller möjlig, enligt definitionen nedan) kommer att uppnås med hjälp av Persons r.

Provstorlek och kraft:

I denna prospektiva longitudinella studie kommer patienter med hög sannolikhet att utveckla IPA (dvs patienter med diagnosen akut leukemi) att inkluderas vid diagnos. Eftersom vårt center utför baslinje-CT-screening av bröstet för att identifiera potentiell IPA vid baslinjen, kan VOC som samlas in efter normal röntgenbild fungera som gott om kontroller. Minst 15 % av dessa patienter fortsätter att utveckla IPA under de följande månaderna,(3), vilket begränsar den urvalsstorlek som behövs vid rekryteringen. Baserat på tidigare rapporterad efterlevnad av uppföljning (12) förväntar vi oss att avhoppsfrekvensen är låg, vilket möjliggör upptäckt av tidigare svårfångade förändringar efter behandling i VOC-profiler.

För dessa beräkningar antog vi den tidigare rapporterade VOC-analysernas känslighet (jämfört med mikrobiologi eller antigentestning i luftvägssekret, BAL eller patientserum) på 80-95 % vardera.(10) Nyligen genomförda retrospektiva undersökningar har identifierat incidensen av IPA till 5 % vid initial screening CT och ytterligare 10 % under den initiala sjukhusvistelsen.(3) Detta översätts till en uppskattad urvalsstorlek på 124 patienter, beräknad under antagandet om accepterad signifikans (alfa = 0,05) och styrka (beta = 0,8). Om man tillåter uppskattningsvis 70 % inskrivning och ytterligare 15 % uteslutningsfrekvens, är den totala uppskattade urvalsstorleken 208 patienter. Genom att prognostisera den genomsnittliga årliga incidensen av 90 nya fall av akut leukemi som behandlas på vårt sjukhus, bör detta provtagningsmål lätt nås inom den fördefinierade rekryteringsperioden på 30 månader. Vi räknar därmed med att antalet deltagare blir 300.

ETISKA ÖVERVÄGANDEN Utvecklingen och förbättringen av icke-invasiva tekniker för IPA-identifiering har varit det uttalade målet för olika professionella sällskap i över två decennier. (1,4) Patienternas föreslagna diagnostiska verktyg är minimalt eller inget besvär för deltagarna, och vi anser att potentiella biverkningar och faror är försumbara i denna helt icke-invasiva modalitet.

Efter datautvinning ska all data tas bort från all identifiering inklusive namn, efternamn, ID-nummer, ärendenummer, födelsedatum och adress - allt förstörs när den första datautvinningen är klar. Data ska lagras säkert på en RAS-krypterad, designad SD-enhet i händerna på PI, vilket minimerar sannolikheten för att denna studie påverkar datasekretess eller medicinsk sekretess för de inkluderade patienterna. Med tanke på den direkta effekt resultaten av denna undersökning kan ha på hanteringen och prognosen för svårt sjuka, finner vi att fördelarna med denna studie överväger eventuella risker.

Finansiering Ingen extern finansiering har lämnats till denna studie hittills.

Bibliografi

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. En klinisk algoritm för att diagnostisera invasiv pulmonell aspergillos hos kritiskt sjuka patienter. Am J Respir Crit Care Med. 1 juli 2012;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et al. Epidemiologi av invasiv svampsjukdom hos hematologiska patienter. Mykoser. 2021 Mar;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y, et al. Baseline Chest Computed Tomography för tidig diagnos av invasiv pulmonell aspergillos hos hemato-onkologiska patienter: en prospektiv kohortstudie. Clin Infect Dis. 2019 30 okt;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et al. Revidering och uppdatering av konsensusdefinitionerna av invasiv svampsjukdom från den europeiska organisationen för forskning och behandling av cancer och mycoses studiegrupp utbildning och forskningskonsortium. Clin Infect Dis. 2020 sep 12;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Nya banbrytande metabolitbaserade diagnostiska verktyg för aspergillos. PLoS Pathog. 2017 sep 7;13(9):e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang H-C, Chang C-J, Liang S-K, et al. Utforskar flyktiga organiska föreningar i andetag för att förutsäga lungcancer med hög precision. Cancer (Basel). 2021 mars 21;13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et al. Virusinducerade flyktiga organiska föreningar kan detekteras i utandningsandning under lunginfektion. Am J Respir Crit Care Med. 2021 nov 1;204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Förutsäga astma med hjälp av kliniska index. Främre Pediatr. 31 juli 2019; 7:320.
9. Das S, Pal M. Review-Non-Invasive Monitoring of Human Health by Exhaled Breath Analysis: A Comprehensive Review. J Electrochem Soc. 3 februari 2020;167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM, et al. En sekundär metabolitsignatur för andningssvamp för att diagnostisera invasiv aspergillos. Clin Infect Dis. 2014 15 dec;59(12):1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y, et al. Utandade flyktiga organiska föreningar för att identifiera patienter med kronisk pulmonell aspergillos. Front Med (Lausanne). 2021 23 september; 8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Diagnostisk roll för polymeraskedjereaktion i bronkoalveolär sköljvätska för invasiv pulmonell aspergillos hos patienter med nedsatt immunförsvar - En retrospektiv kohortstudie. Int J Infect Dis. 2019 juni;83:20-5.