VOC in Atemproben zur Diagnose von IPA

HINTERGRUND Die Diagnose einer invasiven pulmonalen Aspergillose (IPA) hat schwerwiegende Auswirkungen auf die Prognose und den Behandlungsplan des immunsupprimierten Patienten. Die Allgegenwärtigkeit von Aspergillus spp. in der Umwelt und damit auch die Allgegenwärtigkeit solcher Isolate im Atmungssystem gesunder Probanden stellt eine große diagnostische Herausforderung dar. Insbesondere die Unterscheidung zwischen IPA und nicht-invasiver Besiedlung der Atemwege kann eine Herausforderung darstellen. Der enorme Anstieg der Prävalenz immunsupprimierter Patienten, einschließlich bösartiger Erkrankungen und onkologischer Behandlungen, hämatopoetischer Stammzellen und Organtransplantationen sowie immunmodulatorischer Medikamente, verschärft dieses Dilemma.(1) Insbesondere Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) haben ein hohes Risiko, eine IPA zu entwickeln, wobei 5–15 % dieser Patienten in den ersten drei Monaten nach der AML-Diagnose eine IPA entwickeln.(1–3) Da bei bis zu 5 % der Patienten mit AML zum Zeitpunkt der Vorstellung eine IPA vorliegen kann, werden Patienten, die mit einer neuen AML-Diagnose ins Rambam Medical Center (RMC) eingeliefert werden, routinemäßig einer Thorax-Computertomographie (CT) unterzogen, die als Screening auf das Vorliegen einer IPA zum Zeitpunkt der Diagnose dient und eine Grundlage für weitere Referenzen, falls später ein Verdacht auf IPA besteht.(3) Die Diagnose einer wahrscheinlichen oder nachgewiesenen IPA bei einem AML-Patienten erfordert aussagekräftige Bildgebungsbefunde zusammen mit mikrobiologischen Beweisen. Während die Diagnose in einigen Fällen mithilfe von Biomarkern (hauptsächlich dem D-Galactomannan-Antigen und/oder der Polymerasekettenreaktion von Aspergillus spp.) im peripheren Blut gestellt werden kann, ist die Empfindlichkeit dieser Tests gering und dieser minimalinvasive Ansatz liefert oft keine ausreichende diagnostische Sicherheit. In solchen Fällen wird meist eine Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage durchgeführt. Dieses invasive Verfahren ist besonders gefährlich bei Patienten mit Verdacht auf IPA, von denen die überwiegende Mehrheit aufgrund ihrer Grunderkrankung sehr gebrechlich ist.(4) Diese Überlegungen haben zur Suche nach zusätzlichen, nicht-invasiven Modalitäten bei der Diagnose von IPA geführt. (5) Ein solcher Ansatz war die Analyse flüchtiger organischer Verbindungen (VOC) in ausgeatmeten Luftproben. Die VOC-Profilanalyse der ausgeatmeten Luft zeichnet sich durch einen niedrigen Dampfdruck bei Raumtemperatur aus und ist ein aufstrebendes Diagnostikgebiet mit dem Potenzial für nicht-invasives Screening und Diagnose verschiedener Krankheiten, einschließlich Neoplasien (6), Infektionen (7) und entzündlicher Prozesse. (8) Frühere Studien haben potenzielle VOC-Marker für metabolisch aktive Aspergillus spp. (9) identifiziert, wobei eine kleine prospektive Studie am Menschen (10) eine ermutigende diagnostische Leistung für die VOC-basierte IPA-Identifizierung zeigte. Diese Versuche wurden jedoch durch mehrere Fallstricke behindert. Erstens scheinen die VOC-Profile von In-vitro-Aspergillus spp. wenig Zusammenhang mit den VOCs zu haben, die in der Atemanalyse kolonisierter Patienten gefunden wurden.(5) Zweitens neigen ausgeatmete VOCs dazu, sich von Person zu Person stark zu unterscheiden, was das Fehlen zeitlicher Kontrollen (d. h. Änderungen des VOC-Profils bei derselben Person vor und nach der IPA-Entwicklung) zu einem entscheidenden Vorbehalt macht.(10) Drittens haben unseres Wissens keine Längsschnittstudien die Reaktion von VOC-Profilen auf die IPA-Behandlung bewertet.

In dieser prospektiven Längsschnittstudie wollen wir diese Hürden überwinden und dabei zwei Schlüsselmerkmale von hämatologischen Patienten nutzen, die bei RMC behandelt werden. Erstens weisen Patienten mit neu diagnostizierter AML eine relativ hohe IPA-Prävalenz auf. Zweitens wird bei allen Patienten bei der Diagnose einer AML eine Thorax-CT durchgeführt. Daher dient die Entnahme von Atemproben von Patienten mit normalem CT-Ausgangswert als Negativkontrolle und ermöglicht den Vergleich von VOC-Profilen vor und nach der Entwicklung von IPA bei demselben Patienten. Weitere Probenahmen, nachdem sich der Patient von der IPA erholt hat, ermöglichen eine zusätzliche Längskontrolle.

ZIELE Die Identifizierung von VOC-Profilen, die IPA in Atemproben vorhersagen

METHODEN

Studiendesign:

Dies ist eine nicht randomisierte, prospektive Kohortenstudie mit einem einzigen Zentrum. Atemproben von einwilligenden Patienten werden zum Zeitpunkt des ersten CT-Screenings auf IPA auf VOC-Profile analysiert. Darüber hinaus werden zum Zeitpunkt der Diagnose einer möglichen, wahrscheinlichen oder bestätigten IPA (definiert gemäß den EORTC-Kriterien (4), wie unten beschrieben) Proben entnommen.

Rahmen und Teilnehmer:

Angesprochen werden Patienten mit neu diagnostizierter AML, die eine Behandlung in der Hämatologieabteilung des RMC einleiten. Der Aufnahmezeitraum dauert vom 1. Oktober 2022 bis zum 31. März 2025.

Einschlusskriterien:

Neudiagnose einer akuten myeloischen Leukämie UND/ODER geplante Transplantation hämatopoetischer Stammzellen (HCT) Thorax-CT, durchgeführt innerhalb von 30 Tagen nach der Probenahme bei Personen im Alter von 18 Jahren oder älter. Die Möglichkeit, Gezeitenatemproben von insgesamt 10 l direkt in einen Tedlar-Beutel zu liefern

Ausschlusskriterien:

Jeder Zustand, der die Fähigkeit des Patienten zur Einwilligung nach Aufklärung beeinträchtigt

Beispielsammlung:

Atemproben werden in einem der 23 speziellen Krankenhausräume unserer hämatologischen Abteilung gesammelt – unter Überdruck und klimatisiert mit E-pure-HEPA-Filtern (High Efficiency Particulate Air) (ADS-Laminaire, Israel). Die Patienten müssen in den 6 Stunden vor der Probenentnahme auf Zähneputzen, Zahnwaschen, Essen, Trinken oder Rauchen verzichten. Nach 10-minütigem Sitzen (um einen durch körperliche Betätigung verursachten Anstieg der Isoprenkonzentration zu vermeiden (11)) wird der Patient gebeten, 10 l Atemluft in einen Tedlar-Beutel (SKC, Südkorea) zu füllen. Gleichzeitig soll ein identischer Tedlar-Beutel mit Umgebungsluft gefüllt werden.

Bei jeder Probenentnahme werden folgende Daten erfasst:

Merkmale des Patienten, einschließlich Alter, hämatoonkologische Diagnose, Zeit seit der Erstdiagnose, aktuelle Behandlung, Zeit ab HCT, falls zutreffend, Hintergrunddiagnosen. Aktuelle pharmakologische Behandlung, einschließlich aller im Vormonat verschriebenen Antibiotika und Antimykotika.

Aktuelle diagnostische Tests, einschließlich aller Kulturen, serologische Tests, Nukleinsäureamplifikationsstudien, vollständiges Blutbild und Blutchemie, Voriconazol-Plasmaspiegel und Brustbildgebung, die im letzten Monat durchgeführt wurden.

Probenhandhabung und VOC-Extraktion:

Alle Tedlar-Beutel werden nach der Abholung bei 4 °C gelagert. Die Adsorption an zwei parallelen Thermodesorptionsröhrchen muss mit der Gilian LFS-113 Low Flow Personal Air Sampling Pump (SRA Instruments, Mailand, Italien) innerhalb von 72 Stunden nach der Probenahme erfolgen und unter Umgebungsbedingungen gelagert werden. Diese Proben werden beschriftet (kodiert) und an das Labor für Umweltchemie (Kasali-Institut für Chemie, Hebräische Universität Jerusalem, Israel) weitergeleitet.

Analytik:

Die thermische Desorption wird bei 290 °C für 20 Minuten unter Verwendung von Heliumgas analytischer Qualität (99,999 %) als Träger durchgeführt. Die Injektion zur Tandem-Gaschromatographie-Massenspektroskopie (GC-MS) muss bei ähnlichen Einlasstemperaturen durchgeführt werden, die den Durchfluss von 40 ml/min nicht überschreiten dürfen. Das anfängliche GC-Temperaturprogramm ahmt zuvor berichtete (10) Protokolle nach: 40 °C für 3 Minuten, erhöht auf 70 °C mit einer Geschwindigkeit von 5 °C pro Minute und gehalten für 3 Minuten, erhöht auf 203 °C bei 7 °C pro Minute erhitzt und 4 Minuten lang gehalten, dann schnell auf 270 °C erhöht und 5 Minuten lang gehalten. Ein Triple-Quad-Massenspektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) soll im Tandem geschaltet werden, mit einem Massenmessbereich von 20–400 m/z.

Die Diagnose einer invasiven pulmonalen Aspergillose wird gemäß den aktualisierten EORTC-Kriterien (4) als eine der folgenden Definitionen definiert:

Bestätigte IPA, definiert als Atemwegsbiopsieprobe mit positiver Kultur von Aspergillus spp. oder histopathologischem Nachweis einer Gewebeinvasion durch Hyphen.

„Wahrscheinliche IPA“, definiert (1) als kompatible radiologische Merkmale im Thorax-CT (dichte, gut umschriebene Läsion(en) mit oder ohne Halo-Zeichen, Luftsichelzeichen oder Hohlraum) und eines der folgenden Merkmale: Nachweis von Aspergillus spp nach Zytologie, direkter Mikroskopie oder Kultur aus allen Atemwegsproben, einschließlich Sputum, bronchoalveolärer Lavage (BAL)-Flüssigkeit oder Bronchialbürste. Positives D-Galactomannan-Antigen im Plasma, Serum oder BAL-Flüssigkeit nachgewiesen. Positive Polymerasekettenreaktion (PCR) für Aspergillus spp in Plasma, Serum oder BAL-Flüssigkeit nachgewiesen „Mögliche IPA“, definiert (1) als kompatible radiologische Merkmale im Thorax-CT (dichte, gut umschriebene Läsion(en) mit oder ohne Halo-Zeichen, Luftsichelzeichen oder Hohlraum ) ohne bestätigende Laborbefunde.

Zusätzliche Informationen zur Wahrscheinlichkeit einer IPA-Diagnose werden von zwei unabhängigen Beobachtern (I.G. und A.S.) gesammelt, die am Ende des Studienzeitraums die vollständige elektronische Krankenakte (EMR) überprüfen und einen einzigen Wahrscheinlichkeitswert von 1 bis 10 vergeben (wobei 1 sehr niedrig ist). (Wahrscheinlichkeit einer IPA, 10 entspricht einer nahezu sicheren IPA) angesichts des gesamten klinischen Krankheitsverlaufs.

Zusätzliche Variablen und Datenquellen: Für alle Kohortenpatienten werden epidemiologische und klinische Informationen aus dem in unserem Krankenhaus verwendeten elektronischen Krankenaktensystem (EMR) des Krankenhauses extrahiert, das mit Hilfe der MD-Clone-Software abgerufen wird. Wir müssen die persönlichen Daten der Patienten einholen, um auf ihre Daten zugreifen zu können, die bei der täglichen Nachuntersuchung in ihrer Krankenakte erfasst werden, da einige Daten nicht kodiert sind. Alle Daten werden später kodiert und alle persönlichen Identifikatoren wie Vor- und Nachname, Geburtsdatum, Ausweisnummer und Adresse werden entfernt. Alle Daten werden auf einer dafür vorgesehenen Festplatte beim Hauptermittler gespeichert. Zu den Datenquellen gehören die Patientenakte im EMR-Register „prometheus“ sowie abgerufene Daten mithilfe der MD-Clone-Software. Zu den gesammelten Daten gehören: demografische Daten (Alter, Geschlecht), Hintergrunddiagnosen, Aufenthaltsdauer und Verlegung in andere Einheiten, Laborergebnisse, aufgezeichnete Vitalfunktionen und die verwendete Oxygenierungsmethode, wie in der täglichen Nachuntersuchung dokumentiert.

Probenentnahmeplan: Die erste Probe der in diese Studie einbezogenen einwilligenden Patienten wird innerhalb von 7 Tagen nach der Brust-CT zu Studienbeginn entnommen. Anschließend werden bei jedem klinischen Verdacht auf IPA durch den behandelnden Arzt – ein Verdacht, der unweigerlich zur Durchführung einer Thorax-CT führt – innerhalb von 7 Tagen nach der Thorax-CT Proben entnommen. Zusätzliche Proben werden innerhalb von 7 Tagen nach Absetzen der Antimykotika-Behandlung durch den behandelnden Arzt entnommen. Der Probenahmeplan ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1 – Stichprobenstrategie. Die Intervention dieser Studie beschränkt sich auf die rot unterstrichene Probenahme – alle anderen Schritte sind Teil der üblichen Behandlung von AML-Patienten und werden durch die Teilnahme an dieser Studie in keiner Weise beeinträchtigt. AML – Akute myeloische Leukämie; Dx – Diagnose; CT – Computertomographie; IPA – Invasive pulmonale Aspergillose; Tx – Behandlung; d/c – eingestellt; GGO – Mattglas-Trübungen.

Datenverarbeitung und statistische Analyse:

Klinische Daten werden gegebenenfalls mithilfe deskriptiver Statistiken sowie parametrischer und nichtparametrischer Tests analysiert. Alle statistischen Analysen müssen mit der R-Softwareversion 4.0.0 („Arbor Day“) oder höher durchgeführt werden. Alle identifizierbaren Daten, einschließlich der Ausgangsmerkmale des Patienten, der Labor- und Bildgebungsergebnisse sowie früherer Diagnosen und Behandlungsaufzeichnungen, werden vom Hauptprüfer für die Dauer der Studie auf einem dafür vorgesehenen RAS-verschlüsselten Festphasenspeichergerät gespeichert. Namen, ID-Nummern, Adresse und Geburtsdatum des Patienten werden nicht gespeichert.

Die Ergebnisse der Massenspektroskopie werden mit der MassHunter-Workstation und -Software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) überprüft. Die partielle Diskriminierungsanalyse der kleinsten Quadrate wird mit der SIMCA-Softwareversion 14.0 oder höher (MKS Umetrics, Schweden) durchgeführt. Für jeden m/z-Bereich wird ein logistisches Regressionsmodell erstellt, das die Berechnung der Variablenbedeutung für die Projektion (VIP) ermöglicht. Für alle VIPs ≥1 wird das entsprechende Ionenprofil als potenzielles Ziel ausgewählt. Diese werden mit zuvor beteiligten Metaboliten verglichen, die auf IPA hinweisen (10,11), sowie mit unserer bestehenden Datenbank, wie in ANHANG A zusammengefasst. Eine solche Identifizierung ist von entscheidender Bedeutung, da derselbe m/z-Wert verschiedenen Metaboliten als unterschiedlichen Substanzen entsprechen kann können das gleiche Keimplasma-Ladungsverhältnis haben. Anschließend werden alle identifizierten Substanzen anhand der 11-Massenspektralbibliothek des National Institute of Standards and Technology (NIST) (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) und eines reinen chemischen Standards bestätigt. Schließlich wird die aus den ausgewählten charakteristischen VOCs bestehende digitale Matrix in Python (Version 3.10.5 oder höher) importiert, um verschiedene Klassifizierungsmodelle zu erstellen, wobei die Vorhersageleistung durch binäre logistische Regression bewertet wird. Die Korrelationen zwischen den VOC-Expressionsniveaus in der Ausatemluft und den Serum- und BAL-d-Gallactomannan- und IPA-Diagnosesicherheit (bestätigt, wahrscheinlich oder möglich, wie unten definiert) werden unter Verwendung des r der Person ermittelt.

Probengröße und Leistung:

In dieser prospektiven Längsschnittstudie werden Patienten mit hoher Wahrscheinlichkeit, an IPA zu erkranken (d. h. Patienten, bei denen eine akute Leukämie diagnostiziert wurde), zum Zeitpunkt der Diagnose aufgenommen. Da unser Zentrum zu Studienbeginn ein Thorax-CT-Screening durchführt, um potenzielle IPA zu Beginn zu identifizieren, können VOC, die nach einer normalen Radiographie gesammelt wurden, als ausreichende Kontrollen dienen. Mindestens 15 % dieser Patienten entwickeln in den folgenden Monaten eine IPA (3), was die bei der Rekrutierung erforderliche Stichprobengröße begrenzt. Basierend auf zuvor gemeldeten Einhaltung der Nachuntersuchungen(12) gehen wir davon aus, dass die Abbrecherquote niedrig sein wird, was die Erkennung zuvor schwer fassbarer Veränderungen der VOC-Profile nach der Behandlung ermöglicht.

Für die Zwecke dieser Berechnungen gingen wir von einer Sensitivität der zuvor berichteten VOC-Assays (im Vergleich zu Mikrobiologie- oder Antigentests in Atemsekreten, BAL oder Patientenserum) von jeweils 80–95 % aus.(10) Jüngste retrospektive Untersuchungen haben ergeben, dass die IPA-Inzidenz bei der ersten Screening-CT bei 5 % und bei der ersten Krankenhauseinweisung bei weiteren 10 % liegt.(3) Dies entspricht einer geschätzten Stichprobengröße von 124 Patienten, berechnet unter der Annahme der akzeptierten Signifikanz (Alpha = 0,05) und Trennschärfe (Beta = 0,8). Unter Berücksichtigung einer geschätzten Einschreibung von 70 % und der zusätzlichen Ausschlussrate von 15 % beträgt die geschätzte Gesamtstichprobengröße 208 Patienten. Unter Berücksichtigung der durchschnittlichen jährlichen Inzidenz von 90 neuen Fällen akuter Leukämie, die in unserem Krankenhaus behandelt werden, sollte dieses Stichprobenziel innerhalb des vorgegebenen Rekrutierungszeitraums von 30 Monaten problemlos erreicht werden können. Wir rechnen daher mit einer Teilnehmerzahl von 300.

ETHISCHE ÜBERLEGUNGEN Die Entwicklung und Verbesserung nichtinvasiver Techniken zur IPA-Identifizierung ist seit über zwei Jahrzehnten das erklärte Ziel verschiedener Fachgesellschaften. (1,4) Das vom Patienten vorgeschlagene Diagnosetool stellt für die Teilnehmer nur minimale bis gar keine Unannehmlichkeiten dar, und wir halten potenzielle Nebenwirkungen und Gefahren bei dieser völlig nicht-invasiven Modalität für vernachlässigbar.

Nach der Datenextraktion werden alle Daten von jeglicher Identifikation befreit, einschließlich Vorname, Nachname, ID-Nummer, Fallnummer, Geburtsdatum und Adresse – alles wird vernichtet, wenn die erste Datenextraktion abgeschlossen ist. Die Daten werden sicher auf einem RAS-verschlüsselten, dafür vorgesehenen SD-Gerät in den Händen des PI gespeichert, wodurch die Wahrscheinlichkeit minimiert wird, dass diese Studie den Datenschutz oder die medizinische Schweigepflicht der eingeschlossenen Patienten beeinträchtigt. Angesichts der direkten Auswirkungen, die die Ergebnisse dieser Untersuchung auf das Management und die Prognose von Schwerkranken haben können, sind wir der Meinung, dass der Nutzen dieser Studie alle potenziellen Risiken überwiegt.

Finanzierung Für diese Studie wurden bisher keine externen Mittel bereitgestellt.

Literaturverzeichnis

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. Ein klinischer Algorithmus zur Diagnose einer invasiven Lungenaspergillose bei kritisch kranken Patienten. Am J Respir Crit Care Med. 1. Juli 2012;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et al. Epidemiologie invasiver Pilzerkrankungen bei hämatologischen Patienten. Mykosen. 2021 März;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y, et al. Basis-Thorax-Computertomographie zur Frühdiagnose invasiver pulmonaler Aspergillose bei hämatoonkologischen Patienten: Eine prospektive Kohortenstudie. Clin Infect Dis. 30. Okt. 2019;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et al. Überarbeitung und Aktualisierung der Konsensdefinitionen der Europäischen Organisation für Forschung und Behandlung von Krebs und des Bildungs- und Forschungskonsortiums der Mykose-Studiengruppe für invasive Pilzerkrankungen. Clin Infect Dis. 12.09.2020;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Neuartige, hochmoderne, auf Metaboliten basierende Diagnosetools für Aspergillose. PLoS Pathog. 7. September 2017;13(9):e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang H-C, Chang C-J, Liang S-K, et al. Erforschung flüchtiger organischer Verbindungen im Atem für eine hochpräzise Vorhersage von Lungenkrebs. Krebserkrankungen (Basel). 21. März 2021;13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et al. Virusinduzierte flüchtige organische Verbindungen sind bei einer Lungeninfektion in der ausgeatmeten Luft nachweisbar. Am J Respir Crit Care Med. 2021 1. Nov.;204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Vorhersage von Asthma anhand klinischer Indizes. Front Pädiatr. 31.07.2019;7:320.
9. Das S, Pal M. Rezension – Nicht-invasive Überwachung der menschlichen Gesundheit durch Analyse der ausgeatmeten Atemluft: Eine umfassende Übersicht. J Electrochem Soc. 3. Februar 2020;167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM, et al. Eine Signatur eines Sekundärmetaboliten von Atempilzen zur Diagnose einer invasiven Aspergillose. Clin Infect Dis. 15. Dezember 2014;59(12):1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y, et al. Ausgeatmete flüchtige organische Verbindungen zur Identifizierung von Patienten mit chronischer Lungenaspergillose. Front Med (Lausanne). 23.09.2021;8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Diagnostische Rolle der Polymerasekettenreaktion in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit bei invasiver pulmonaler Aspergillose bei immungeschwächten Patienten – Eine retrospektive Kohortenstudie. Int J Infect Dis. 2019 Jun;83:20-5.