VOC w próbkach wydychanego powietrza do diagnozy IPA

WPROWADZENIE Rozpoznanie inwazyjnej aspergilozy płucnej (IPA) ma poważne implikacje dla rokowania i planu leczenia pacjenta z obniżoną odpornością. Wszechobecność Aspergillus spp w środowisku, a co za tym idzie wszechobecność takich izolatów w układzie oddechowym osób zdrowych, stanowi duże wyzwanie diagnostyczne. Mianowicie różnicowanie IPA od nieinwazyjnej kolonizacji dróg oddechowych może być trudne. Ogromny wzrost częstości występowania pacjentów z obniżoną odpornością, w tym z nowotworami złośliwymi i leczeniem onkologicznym, hematopoetycznymi komórkami macierzystymi i przeszczepami narządów miąższowych oraz lekami immunomodulującymi, uwydatnia ten dylemat.(1) W szczególności pacjenci z ostrą białaczką szpikową (AML) są narażeni na wysokie ryzyko rozwoju IPA, przy czym u 5-15% takich pacjentów rozwija się IPA w ciągu pierwszych 3 miesięcy po rozpoznaniu AML.(1-3) Ponieważ do 5% pacjentów z AML może mieć IPA podczas prezentacji, pacjenci przyjmowani do Rambam Medical Center (RMC) z nową diagnozą AML rutynowo poddawani są tomografii komputerowej klatki piersiowej (CT), która służy jako badanie przesiewowe na obecność IPA w chwili rozpoznania oraz punkt odniesienia do dalszych badań w przypadku późniejszego podejrzenia IPA(3). Rozpoznanie prawdopodobnego lub potwierdzonego IPA u pacjenta z AML wymaga sugestywnych wyników badań obrazowych wraz z dowodami mikrobiologicznymi. Chociaż w niektórych przypadkach diagnozę można postawić za pomocą biomarkerów (głównie antygenu d-galaktomannanu i/lub reakcji łańcuchowej polimerazy Aspergillus spp) we krwi obwodowej, czułość tych testów jest niska i często to minimalnie inwazyjne podejście nie daje wystarczającej pewności diagnostycznej. W takich przypadkach zwykle wykonuje się bronchoskopię z płukaniem oskrzelowo-pęcherzykowym. Ta inwazyjna procedura jest szczególnie niebezpieczna u pacjentów z podejrzeniem IPA, z których zdecydowana większość jest bardzo słaba z powodu choroby podstawowej.(4) Te rozważania doprowadziły do ​​poszukiwania dodatkowych, nieinwazyjnych metod diagnostycznych w IPA. (5) Jednym z takich podejść była analiza lotnych związków organicznych (LZO) w próbkach wydychanego powietrza. Charakteryzująca się niską prężnością par w temperaturze pokojowej analiza profilu LZO w wydychanym powietrzu jest wschodzącą dziedziną diagnostyki, z potencjałem nieinwazyjnego badania przesiewowego i diagnozowania różnych chorób, w tym nowotworów(6), infekcji(7) i procesów zapalnych. (8) We wcześniejszych badaniach zidentyfikowano potencjalne markery LZO aktywnych metabolicznie Aspergillus spp(9), a jedno małe badanie prospektywne na ludziach(10) wykazało zachęcającą skuteczność diagnostyczną dla identyfikacji IPA na podstawie LZO. Jednak próby te zostały utrudnione przez kilka pułapek. Po pierwsze, profile LZO Aspergillus spp in vitro wydają się mieć niewielki związek z LZO stwierdzonymi w analizie oddechu skolonizowanych pacjentów.(5) Po drugie, wydychane lotne związki organiczne mają tendencję do znacznego różnicowania się między poszczególnymi osobami, co sprawia, że ​​brak kontroli czasowych (tj. zmian profilu LZO u tej samej osoby przed i po rozwinięciu się IPA) jest kluczowym zastrzeżeniem.(10) Po trzecie, według naszej wiedzy żadne badania podłużne nie oceniały odpowiedzi profili LZO na leczenie IPA.

W tym prospektywnym badaniu podłużnym naszym celem jest przezwyciężenie tych przeszkód, wykorzystując dwie kluczowe cechy pacjentów hematologicznych leczonych w RMC. Po pierwsze, pacjenci z nowo zdiagnozowaną AML mają stosunkowo wysoką częstość występowania IPA. Po drugie, przy rozpoznaniu AML u wszystkich pacjentów wykonuje się TK klatki piersiowej. Zatem pobieranie próbek oddechu od pacjentów z prawidłowym wyjściowym CT będzie służyć jako kontrola negatywna, umożliwiając porównanie profili VOC przed i po rozwoju IPA u tego samego pacjenta. Dalsze pobieranie próbek po wyzdrowieniu pacjenta z IPA zapewni dodatkową kontrolę podłużną.

CELE Identyfikacja profili VOC predykcyjnych dla IPA w próbkach oddechu

METODY

Projekt badania:

Jest to jednoośrodkowe, nierandomizowane, prospektywne badanie kohortowe. Próbki oddechu od pacjentów wyrażających zgodę zostaną przeanalizowane pod kątem profili VOC w czasie wstępnego badania przesiewowego CT w kierunku IPA. Ponadto próbki zostaną również pobrane w momencie rozpoznania ewentualnego, prawdopodobnego lub potwierdzonego IPA (zdefiniowanego zgodnie z kryteriami EORTC (4) wyszczególnionymi poniżej).

Otoczenie i uczestnicy:

Pacjenci z nowo rozpoznaną AML rozpoczynający leczenie na oddziale hematologii RMC będą przyjmowani. Okres włączenia będzie trwał od 1 października 2022 r. do 31 marca 2025 r.

Kryteria przyjęcia:

Nowa diagnoza ostrej białaczki szpikowej I/LUB planowana transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HCT) TK klatki piersiowej wykonane w ciągu 30 dni od pobrania próbki Wiek 18 lat lub starszy Możliwość dostarczenia próbek oddechu oddechowego o łącznej objętości 10 l bezpośrednio do worka Tedlar

Kryteria wyłączenia:

Każdy stan upośledzający zdolność pacjenta do wyrażenia świadomej zgody

Kolekcja próbek:

Próbki oddechu będą pobierane w jednej z 23 dedykowanych sal szpitalnych naszego oddziału hematologicznego - z dodatnim ciśnieniem i klimatyzacją z filtrami E-pure o wysokiej wydajności cząstek stałych (HEPA) (ADS-Laminaire, Izrael). Pacjenci będą zobowiązani do powstrzymania się od mycia zębów, mycia zębów, jedzenia, picia lub palenia w ciągu 6 godzin przed pobraniem próbki. Po 10 minutach siedzenia (aby uniknąć wzrostu stężenia izoprenu wywołanego wysiłkiem fizycznym (11)), pacjent zostanie poproszony o napełnienie 10 l oddechu pływowego do worka telarowego (SKC, Korea Południowa). Jednocześnie identyczny worek telarowy należy napełnić powietrzem z otoczenia.

Po każdym pobraniu próbki zostaną zapisane następujące dane:

Charakterystyka pacjenta, w tym wiek, rozpoznanie hemato-onkologiczne, czas od wstępnego rozpoznania, obecne leczenie, czas od HCT, jeśli dotyczy, podstawowe rozpoznania Aktualne leczenie farmakologiczne, w tym wszystkie antybiotyki i leki przeciwgrzybicze przepisane w poprzednim miesiącu.

Aktualne badania diagnostyczne, w tym wszystkie posiewy, testy serologiczne, badania amplifikacji kwasów nukleinowych, morfologia i chemia krwi, poziom worykonazolu w osoczu i obrazowanie klatki piersiowej wykonane w ciągu ostatniego miesiąca.

Postępowanie z próbkami i ekstrakcja LZO:

Wszystkie torby tedlar będą przechowywane w temperaturze 4 ℃ po odbiorze. Adsorpcję na 2 równoległych rurkach do desorpcji termicznej należy przeprowadzić za pomocą osobistej pompy do pobierania próbek powietrza o niskim przepływie Gilian LFS-113 (przyrządy SRA, Mediolan, Włochy), wykonanej w ciągu 72 godzin od pobrania próbki i przechowywanej w warunkach otoczenia. Próbki te zostaną oznakowane (zakodowane) i przekazane do Laboratorium Chemii Środowiska (Instytut Chemii Kasali, Uniwersytet Hebrajski w Jerozolimie, Izrael)

Analityka:

Desorpcję termiczną przeprowadza się w temperaturze 290°C przez 20 minut, stosując jako nośnik gazowy hel o czystości analitycznej (99,999%). Wstrzykiwanie do tandemowej chromatografii gazowej ze spektroskopią mas (GC-MS) przeprowadza się przy podobnych temperaturach na wlocie nieprzekraczających przepływu 40 ml/min. Początkowy program temperaturowy GC będzie naśladować wcześniej zgłoszone (10) protokoły: 40˚C przez 3 minuty, podwyższane do 70˚C z szybkością 5˚C na minutę i utrzymywane przez 3 minuty, podnoszone do 203˚C przy 7˚C na minutę i utrzymywano przez 4 minuty, szybko podwyższając do 270˚C i utrzymywano przez 5 minut. Spektrometr masowy typu triple quad (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) należy podłączyć w tandemie, o zakresie pomiaru masy 20-400 m/z.

Rozpoznanie inwazyjnej aspergilozy płucnej zostanie określone zgodnie ze zaktualizowanymi kryteriami EORTC (4) jako jedno z następujących:

Potwierdzony IPA zdefiniowany jako próbka biopsji układu oddechowego z dodatnim posiewem Aspergillus spp lub histopatologicznym dowodem inwazji strzępek w tkance.

„Prawdopodobny IPA”, zdefiniowany (1) jako zgodne cechy radiograficzne w tomografii komputerowej klatki piersiowej (Gęsta, dobrze odgraniczona zmiana (zmiany) z lub bez znaku halo, znaku półksiężyca lub jamy) oraz którekolwiek z poniższych: Dowód na Aspergillus spp na podstawie cytologii, mikroskopii bezpośredniej lub posiewu z dowolnej próbki z układu oddechowego, w tym plwociny, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) lub szczoteczki oskrzelowej Dodatni antygen D-galaktomannanu wykryty w osoczu, surowicy lub płynie z BAL Dodatnia reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) dla Aspergillus spp wykryte w osoczu, surowicy lub płynie BAL „Możliwe IPA”, zdefiniowane (1) jako zgodne cechy radiograficzne w tomografii komputerowej klatki piersiowej (gęsta, dobrze odgraniczona(e) zmiana(y) z lub bez znaku halo, znaku półksiężyca lub jamy ) bez potwierdzających wyników badań laboratoryjnych.

Dodatkowe informacje dotyczące prawdopodobieństwa rozpoznania IPA zostaną zebrane przez dwóch niezależnych obserwatorów (I.G. i A.S.) przeglądających pełną elektroniczną dokumentację medyczną (EMR) na koniec okresu badania, przypisując pojedynczy wynik prawdopodobieństwa 1-10 (1 oznacza bardzo niski prawdopodobieństwo IPA, 10 odpowiadające prawie pewnemu IPA) w świetle pełnego przebiegu klinicznego choroby.

Dodatkowe zmienne i źródła danych: W przypadku wszystkich pacjentów z kohorty informacje epidemiologiczne i kliniczne zostaną pobrane ze szpitalnego systemu elektronicznej dokumentacji medycznej (EMR) używanego w naszym szpitalu, uzyskanego za pomocą oprogramowania MD-clone. Będziemy musieli uzyskać dane osobowe pacjentów, aby uzyskać dostęp do ich danych zapisanych w codziennej obserwacji w ich karcie medycznej, ponieważ niektóre dane nie są zakodowane. Wszystkie dane zostaną później zakodowane i pozbawione jakichkolwiek danych osobowych, w tym imienia, nazwiska, daty urodzenia, numeru identyfikacyjnego i adresu. Wszystkie dane są przechowywane na wyznaczonym dysku twardym znajdującym się w rękach głównego badacza. Źródła danych będą obejmować akta pacjenta w rejestrze EMR „prometheus”, jak również dane pobrane za pomocą oprogramowania MD-clone. Zgromadzone dane będą obejmować: dane demograficzne (wiek, płeć), podstawowe rozpoznania, długość pobytu i przeniesienia do innych jednostek, wyniki badań laboratoryjnych, zarejestrowane parametry życiowe oraz zastosowaną metodę utlenowania udokumentowaną w codziennej obserwacji.

Harmonogram pobierania próbek: Pierwsza próbka od pacjentów, którzy wyrazili zgodę na udział w tym badaniu, zostanie pobrana w ciągu 7 dni od początkowej CT klatki piersiowej. Następnie, po podejrzeniu klinicznym IPA przez lekarza prowadzącego – podejrzeniu, które niezmiennie prowadzi do wykonania TK klatki piersiowej, próbki zostaną pobrane w ciągu 7 dni od TK klatki piersiowej. Dodatkowe próbki zostaną pobrane w ciągu 7 dni od zakończenia leczenia przeciwgrzybiczego przez lekarza prowadzącego. Harmonogram pobierania próbek przedstawiono na rysunku 1.

Rysunek 1 — Strategia pobierania próbek. Interwencja tego badania jest ograniczona do pobierania próbek podkreślonych pogrubioną czerwoną czcionką – wszystkie inne etapy są częścią zwykłego postępowania z pacjentami z AML i udział w tym badaniu w żaden sposób nie ma na nie wpływu. AML – ostra białaczka szpikowa; Dx - Diagnoza; CT - tomografia komputerowa; IPA – inwazyjna aspergiloza płucna; Tx - Leczenie; d/c - wycofane; GGO — matowe zmętnienia szkła.

Obsługa danych i analiza statystyczna:

Dane kliniczne analizuje się z wykorzystaniem, w stosownych przypadkach, statystyk opisowych oraz testów parametrycznych i nieparametrycznych. Wszystkie analizy statystyczne należy przeprowadzać przy użyciu oprogramowania R w wersji 4.0.0 („Dzień Arbor”) lub nowszej. Wszystkie możliwe do zidentyfikowania dane, w tym wyjściowa charakterystyka pacjenta, wyniki laboratoryjne i obrazowe oraz wcześniejsze diagnozy i zapisy dotyczące leczenia, są przechowywane przez głównego badacza na wyznaczonym urządzeniu pamięci stałej z szyfrowaniem RAS na czas trwania badania. Nazwiska pacjentów, numery identyfikacyjne, adres i data urodzenia nie będą przechowywane.

Wyniki spektroskopii masowej zostaną poddane przeglądowi przy użyciu stacji roboczej i oprogramowania MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Analiza dyskryminacji metodą cząstkowych najmniejszych kwadratów zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania SIMCA w wersji 14.0 lub nowszej (MKS Umetrics, Szwecja). Dla każdego przedziału m/z zostanie skonstruowany model regresji logistycznej, pozwalający na obliczenie zmiennej ważności dla projekcji (VIP). Dla wszystkich VIP ≥1 odpowiedni profil jonowy zostanie wybrany jako potencjalny cel. Zostaną one porównane z wcześniej powiązanymi metabolitami wskazującymi na IPA, (10,11), jak również z naszą istniejącą bazą danych, jak podsumowano w ZAŁĄCZNIKU A. Taka identyfikacja jest kluczowa, ponieważ ta sama wartość m/z może odpowiadać różnym metabolitom, ponieważ różne substancje mogą mieć ten sam stosunek ładunku plazmy zarodkowej. Następnie wszystkie zidentyfikowane substancje zostaną potwierdzone przez National Institute of Standards and Technology (NIST) 11 Mass Spectral Library (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) i czysty standard chemiczny. Na koniec cyfrowa matryca złożona z wybranych charakterystycznych LZO zostanie zaimportowana do Pythona (wersja 3.10.5 lub nowsza) w celu skonstruowania różnych modeli klasyfikacyjnych, z wydajnością predykcyjną ocenianą za pomocą binarnej regresji logistycznej. Korelacje między poziomami ekspresji LZO w wydychanym powietrzu a poziomami d-gallaktomannanu w surowicy i BAL oraz pewności diagnostycznej IPA (potwierdzonej, prawdopodobnej lub możliwej, jak zdefiniowano poniżej) zostaną osiągnięte przy użyciu r Persona.

Wielkość próbki i moc:

W tym prospektywnym badaniu podłużnym pacjenci z dużym prawdopodobieństwem rozwoju IPA (tj. pacjenci z rozpoznaniem ostrej białaczki) zostaną włączeni w momencie rozpoznania. Ponieważ nasze centrum przeprowadza podstawowe badania przesiewowe CT klatki piersiowej w celu identyfikacji potencjalnego IPA na początku badania, LZO zebrane po prawidłowym radiografii mogą służyć jako wystarczająca kontrola. U co najmniej 15% takich pacjentów rozwija się IPA w kolejnych miesiącach(3), co ogranicza wielkość próby potrzebną podczas rekrutacji. Opierając się na wcześniej zgłoszonym przestrzeganiu zaleceń dotyczących obserwacji(12), spodziewamy się, że wskaźnik rezygnacji będzie niski, co pozwoli na wykrycie wcześniej nieuchwytnych zmian w profilach LZO po leczeniu.

Na potrzeby tych obliczeń przyjęliśmy wcześniej opisaną czułość testów LZO (w porównaniu z mikrobiologią lub badaniem antygenu w wydzielinach oddechowych, BAL lub surowicy pacjenta) na poziomie 80-95%.(10) Niedawne badania retrospektywne wykazały, że częstość występowania IPA wynosi 5% podczas wstępnej przesiewowej tomografii komputerowej i dodatkowe 10% podczas początkowej hospitalizacji.(3) Przekłada się to na szacunkową wielkość próby 124 pacjentów, obliczoną przy założeniu przyjętej istotności (alfa = 0,05) i mocy (beta = 0,8). Biorąc pod uwagę szacunkowe 70% zapisów i dodatkowe 15% wykluczeń, całkowita szacowana wielkość próby wynosi 208 pacjentów. Prognozując średnią roczną zapadalność na 90 nowych przypadków ostrej białaczki leczonych w naszym szpitalu, ten cel pobierania próbek powinien być łatwo osiągnięty w ciągu wcześniej określonego 30-miesięcznego okresu rekrutacji. Spodziewamy się zatem, że liczba uczestników wyniesie 300.

WZGLĘDY ETYCZNE Rozwój i doskonalenie nieinwazyjnych technik identyfikacji IPA jest deklarowanym celem różnych stowarzyszeń zawodowych od ponad dwudziestu lat. (1,4) Narzędzie diagnostyczne proponowane przez pacjentów nie wiąże się z minimalnymi lub żadnymi niedogodnościami dla uczestników, a potencjalne skutki uboczne i zagrożenia uważamy za nieistotne w przypadku tej całkowicie nieinwazyjnej metody.

Po ekstrakcji danych wszystkie dane zostaną usunięte z wszelkich danych identyfikacyjnych, w tym imienia, nazwiska, numeru identyfikacyjnego, numeru sprawy, daty urodzenia i adresu – wszystkie dane zostaną zniszczone po zakończeniu wstępnej ekstrakcji danych. Dane będą bezpiecznie przechowywane na zaszyfrowanym RAS, wyznaczonym urządzeniu SD w rękach PI, minimalizując prawdopodobieństwo wpływu tego badania na prywatność danych lub poufność medyczną pacjentów objętych badaniem. Ze względu na bezpośredni wpływ, jaki wyniki tego badania mogą mieć na postępowanie i rokowanie ciężko chorych, uważamy, że korzyści płynące z tego badania przewyższają potencjalne ryzyko.

Finansowanie Do tej pory nie zapewniono finansowania zewnętrznego na to badanie.

Bibliografia

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele AM, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N i in. Algorytm kliniczny do diagnozowania inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów w stanie krytycznym. Am J Respir Crit Care Med. 1 lipca 2012;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et al. Epidemiologia inwazyjnej choroby grzybiczej u pacjentów hematologicznych. grzybice. 2021 marzec;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y i in. Wyjściowa tomografia komputerowa klatki piersiowej w celu wczesnego rozpoznania inwazyjnej aspergilozy płucnej u pacjentów z hemato-onkologią: prospektywne badanie kohortowe. Clin Infect Dis. 30 października 2019;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE i in. Rewizja i aktualizacja uzgodnionych definicji inwazyjnych chorób grzybiczych opracowanych przez europejską organizację ds. badań i leczenia raka oraz konsorcjum edukacyjno-badawczego grupy badawczej zajmującej się grzybicą. Clin Infect Dis. 12 września 2020;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Nowe, najnowocześniejsze narzędzia diagnostyczne oparte na metabolitach do aspergilozy. Patog PLoS. 7 września 2017;13(9):e1006486.
6. Tsou PH, Lin ZL, Pan YC, Yang HC, Chang CJ, Liang SK i in. Badanie lotnych związków organicznych w wydychanym powietrzu w celu dokładnego przewidywania raka płuc. Nowotwory (Bazylea). 21 marca 2021;13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T i in. Wywołane przez wirusy lotne związki organiczne są wykrywalne w wydychanym powietrzu podczas infekcji płuc. Am J Respir Crit Care Med. 1 listopada 2021;204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Przewidywanie astmy za pomocą wskaźników klinicznych. Przód Pediatr. 31 lipca 2019;7:320.
9. Das S, Pal M. Przegląd — nieinwazyjne monitorowanie zdrowia człowieka za pomocą analizy wydychanego powietrza: kompleksowy przegląd. J Electrochem Soc. 3 lutego 2020 r.;167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM i in. Sygnatura wtórnego metabolitu grzyba oddechowego do diagnozowania inwazyjnej aspergilozy. Clin Infect Dis. 15 grudnia 2014;59(12):1733-40.
11. Li ZT, Zeng PY, Chen ZM, Guan WJ, Wang T, Lin Y i in. Wydychane lotne związki organiczne do identyfikacji pacjentów z przewlekłą aspergilozą płuc. Front Med (Lozanna). 2021 23 września; 8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Diagnostyczna rola reakcji łańcuchowej polimerazy w płynie z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych w inwazyjnej aspergilozie płuc u pacjentów z obniżoną odpornością - retrospektywne badanie kohortowe. Int J Infekcja. 2019 czerwca;83:20-5.