VOC ve vzorcích dechu pro diagnostiku IPA

STAV TECHNIKY Diagnóza invazivní plicní aspergilózy (IPA) má vážné důsledky pro prognózu a plán léčby imunosuprimovaného pacienta. Všudypřítomnost Aspergillus spp. v životním prostředí a potažmo všudypřítomnost takových izolátů v dýchacím systému zdravých jedinců představuje velkou diagnostickou výzvu. Zejména odlišení IPA od neinvazivní kolonizace dýchacího traktu může být náročné. Obrovský nárůst prevalence pacientů s imunosupresí, včetně malignit a onkologické léčby, krvetvorných kmenových buněk a transplantací solidních orgánů a imunomodulační medikace, toto dilema akcentuje.(1) Zejména pacienti s akutní myeloidní leukémií (AML) jsou vystaveni vysokému riziku rozvoje IPA, přičemž u 5–15 % těchto pacientů se IPA rozvine během prvních 3 měsíců po diagnóze AML.(1–3). Protože až 5 % pacientů s AML může mít při prezentaci IPA, pacienti přijatí do Rambam Medical Center (RMC) s novou diagnózou AML běžně podstupují počítačovou tomografii hrudníku (CT), která slouží jako screening na přítomnost IPA při diagnóze. a základní linie pro další referenci, pokud by později vzniklo podezření na IPA.(3) Diagnóza pravděpodobné nebo prokázané IPA u pacienta s AML vyžaduje sugestivní zobrazovací nálezy spolu s mikrobiologickými důkazy. Zatímco v některých případech lze diagnózu stanovit pomocí biomarkerů (zejména antigenu d-galaktomananu nebo polymerázové řetězové reakce Aspergillus spp) v periferní krvi, citlivost těchto testů je nízká a tento minimálně invazivní přístup často neposkytuje dostatečnou diagnostickou jistotu. V takových případech se obvykle provádí bronchoskopie s bronchoalveolární laváží. Tento invazivní postup je zvláště nebezpečný u pacientů s podezřením na IPA, z nichž velká většina je velmi křehká kvůli základnímu onemocnění.(4) Tyto úvahy vedly k hledání dalších, neinvazivních modalit v diagnostice IPA. (5) Jedním z takových přístupů byla analýza těkavých organických sloučenin (VOC) ve vzorcích vydechovaného vzduchu. Analýza profilu VOC ve vydechovaném vzduchu, vyznačující se nízkým tlakem par při pokojové teplotě, je nově vznikající oblastí diagnostiky s potenciálem neinvazivního screeningu a diagnostiky různých onemocnění, včetně novotvarů,(6) infekcí(7) a zánětlivých procesů. (8) Předchozí studie identifikovaly potenciální markery VOC metabolicky aktivních Aspergillus spp,(9) s jednou malou prospektivní studií u lidí(10), která ukázala povzbudivou diagnostickou výkonnost pro identifikaci IPA na základě VOC. Tyto pokusy však narážely na několik úskalí. Za prvé se zdá, že profily VOC in vitro Aspergillus spp. mají malou souvislost s VOC zjištěnými při analýze dechu kolonizovaných pacientů.(5) Za druhé, vydechované VOC mají tendenci se mezi jednotlivci velmi lišit, takže absence časových kontrol (tj. změny profilu VOC u stejného jedince před a po vývoji IPA) je zásadní upozornění.(10) Za třetí, pokud je nám známo, žádné longitudinální studie nehodnotily odpověď profilů VOC na léčbu IPA.

V této prospektivní longitudinální studii se snažíme překonat tyto překážky s využitím dvou klíčových charakteristik hematologických pacientů léčených v RMC. Za prvé, pacienti s nově diagnostikovanou AML mají relativně vysokou prevalenci IPA. Za druhé, CT hrudníku se provádí při diagnóze AML u všech pacientů. Odebírání vzorků dechu od pacientů s normálním výchozím CT tak bude sloužit jako negativní kontroly, což umožní srovnání profilů VOC před a po rozvoji IPA u stejného pacienta. Další odběr vzorků poté, co se pacient zotaví z IPA, poskytne další longitudinální kontrolu.

CÍLE Identifikace profilů VOC prediktivních pro IPA ve vzorcích dechu

METODY

Studovat design:

Toto je jednocentrová, nerandomizovaná, prospektivní kohortová studie. Vzorky dechu od souhlasných pacientů budou analyzovány na profily VOC v době počátečního CT screeningu na IPA. Kromě toho budou vzorky odebírány také v době diagnózy jakékoli možné, pravděpodobné nebo potvrzené IPA (definované podle kritérií EORTC (4), jak je podrobně uvedeno níže).

Nastavení a účastníci:

Osloveni budou pacienti nově diagnostikovaní s AML zahajující léčbu na hematologickém oddělení RMC. Období zařazení bude od 1. října 2022 do 31. března 2025.

Kritéria pro zařazení:

Nová diagnóza akutní myeloidní leukémie A/NEBO plánovaná transplantace hematopoetických kmenových buněk (HCT) CT hrudníku provedené do 30 dnů od odběru 18 let nebo starší Schopnost poskytnout vzorky dechu v celkovém objemu 10 l přímo do vaku Tedlar

Kritéria vyloučení:

Jakýkoli stav, který zhoršuje schopnost pacienta poskytnout informovaný souhlas

Kolekce vzorků:

Vzorky dechu budou odebírány v jednom z 23 vyhrazených hospitalizačních pokojů našeho hematologického oddělení – pozitivně přetlakovaných a klimatizovaných s vysoce účinnými vzduchovými filtry E-pure (HEPA) (ADS-Laminaire, Izrael). Od pacientů se bude vyžadovat, aby se 6 hodin před odběrem vzorků zdrželi čištění zubů, mytí zubů, jídla, pití nebo kouření. Po 10 minutovém sezení (aby se zabránilo zvýšení koncentrace izoprenu vyvolaného cvičením (11) ), bude pacient požádán, aby naplnil 10 l dechového dechu do tedlarového vaku (SKC, Jižní Korea). Současně se identický tedlarový pytel naplní okolním vzduchem.

Při každém odběru vzorků budou zaznamenány následující údaje:

Charakteristiky pacienta včetně věku, hematoonkologické diagnózy, doby od počáteční diagnózy, aktuální léčby, případně doby od HCT, základní diagnózy Současná farmakologická léčba včetně všech antibiotik a antimykotik předepsaných v předchozím měsíci.

Aktuální diagnostické testy, včetně všech kultur, sérologických testů, amplifikačních studií nukleových kyselin, kompletního krevního obrazu a chemie, hladiny vorikonazolu v plazmě a zobrazení hrudníku provedené během posledního měsíce.

Manipulace se vzorky a extrakce VOC:

Všechny sáčky tedlar budou po odběru skladovány při teplotě 4 °C. Adsorpce na 2 paralelní tepelné desorpční trubice se provede pomocí Gilian LFS-113 nízkoprůtokového osobního vzorkovacího čerpadla vzduchu (SRA instrumenty, Milano, Itálie), provede se do 72 hodin od odběru vzorků a uloží se za podmínek okolního prostředí. Tyto vzorky budou označeny (kódovány) a převedeny do Environmental Chemistry Laboratory (Kasali Institute of Chemistry, Hebrejská univerzita v Jeruzalémě, Izrael)

Analytics:

Tepelná desorpce bude provedena při 290 °C po dobu 20 minut s použitím plynného helia analytické čistoty (99,999 %) jako nosiče. Nástřik k hmotnostní spektroskopii s tandemovou plynovou chromatografií (GC-MS) se provádí při podobných vstupních teplotách nepřesahujících průtok 40 ml/min. Počáteční teplotní program GC bude napodobovat dříve hlášené (10) protokoly: 40˚C po dobu 3 minut, zvýšena na 70˚C rychlostí 5˚C za minutu a udržována po dobu 3 minut, zvýšena na 203˚C při 7˚C za minutu a udržováno po dobu 4 minut, rychle zvýšeno na 270 °C a udržováno po dobu 5 minut. Trojitý quad hmotnostní spektrometr (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) bude zapojen v tandemu s rozsahem měření hmotnosti 20-400 m/z.

Diagnóza invazivní plicní aspergilózy bude definována podle aktualizovaných kritérií EORTC (4) jako jedna z následujících:

Potvrzená IPA definovaná jako vzorek z respirační biopsie s pozitivní kultivací Aspergillus spp nebo histopatologickým průkazem invaze tkáně hyfami.

"Pravděpodobná IPA", definovaná (1) jako kompatibilní radiografické znaky na CT hrudníku (hustá, dobře ohraničená léze s nebo bez halo znaku, znak vzdušného půlměsíce nebo dutina) a některý z následujících: Důkaz Aspergillus spp po cytologii, přímé mikroskopii nebo kultivaci z jakéhokoli respiračního vzorku, včetně sputa, tekutiny z bronchoalveolární laváže (BAL) nebo bronchiálního kartáčku Pozitivní antigen D-galaktomananu detekovaný v plazmě, séru nebo tekutině BAL Pozitivní polymerázová řetězová reakce (PCR) na Aspergillus spp detekovaný v plazmě, séru nebo tekutině BAL „Možná IPA“, definovaný (1) jako kompatibilní radiografické znaky na CT hrudníku (hustá, dobře ohraničená léze s nebo bez halo znaku, znak vzduchového půlměsíce nebo dutina ) bez potvrzujících laboratorních nálezů.

Další informace týkající se pravděpodobnosti diagnózy IPA budou shromažďovány dvěma nezávislými pozorovateli (I.G. a A.S.), kteří na konci období studie zkontrolují úplný elektronický lékařský záznam (EMR) a přiřadí jediné skóre pravděpodobnosti 1-10 (1 je velmi nízké pravděpodobnost IPA, 10 odpovídá téměř jisté IPA) s ohledem na úplný klinický průběh onemocnění.

Další proměnné a zdroje dat: Pro všechny pacienty v kohortě budou epidemiologické a klinické informace extrahovány z nemocničního systému elektronických lékařských záznamů (EMR) používaného v naší nemocnici s pomocí softwaru MD-clone. Budeme potřebovat získat osobní údaje pacientů, abychom měli přístup k jejich údajům zaznamenaným při denní kontrole v jejich lékařské tabulce, protože některá data nejsou kódována. Veškeré údaje budou později zakódovány a odstraněny veškeré osobní identifikátory včetně jména, příjmení, data narození, IČO a adresy. Všechna data budou uložena na určeném pevném disku v rukou hlavního výzkumníka. Zdroje dat budou zahrnovat soubor pacienta v registru EMR "prometheus" a také data získaná pomocí softwaru MD-clone. Shromážděná data budou zahrnovat: demografické údaje (věk, pohlaví), základní diagnózy, délku pobytu a přesun na jiná oddělení, laboratorní výsledky, zaznamenané vitální funkce a použitou okysličovací metodu, jak je dokumentováno při denním sledování.

Plán odběru vzorků: První vzorek souhlasných pacientů zahrnutých do této studie bude odebrán do 7 dnů od výchozího CT hrudníku. Následně, po jakémkoli klinickém podezření na IPA ošetřujícím lékařem – podezření, které vždy vede k provedení CT hrudníku, budou vzorky odebrány do 7 dnů z CT hrudníku. Další vzorky budou odebrány do 7 dnů od ukončení antimykotické léčby ošetřujícím lékařem. Plán odběru vzorků je znázorněn na obrázku 1.

Obrázek 1 – Strategie odběru vzorků. Intervence této studie je omezena na odběr vzorků podtržený tučně červeně – všechny ostatní kroky jsou součástí obvyklého managementu pacientů s AML a nejsou nijak ovlivněny účastí v této studii. AML - akutní myeloidní leukémie; Dx - Diagnóza; CT - Počítačová tomografie; IPA – invazivní plicní aspergilóza; Tx - Léčba; d/c - přerušeno; GGO - Průhlednost zabroušeného skla.

Manipulace s daty a statistická analýza:

Klinická data se analyzují pomocí deskriptivní statistiky, parametrických a neparametrických testů, podle potřeby. Veškeré statistické analýzy se provádějí pomocí softwaru R verze 4.0.0 ("Arbor day") nebo novější. Všechna identifikovatelná data, včetně základních charakteristik pacienta, laboratorních a zobrazovacích výsledků a předchozích diagnóz a záznamů o léčbě, uloží primární zkoušející na určeném RAS šifrovaném paměťovém zařízení s pevnou fází po dobu trvání studie. Jména pacienta, identifikační čísla, adresa a datum narození nebudou uložena.

Výstupy hmotnostní spektroskopie budou přezkoumány pomocí pracovní stanice a softwaru MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Analýza částečné diskriminace metodou nejmenších čtverců bude provedena pomocí softwaru SIMCA verze 14.0 nebo novější (MKS Umetrics, Švédsko). Pro každý rozsah m/z bude zkonstruován logistický regresní model umožňující výpočet proměnné důležitosti pro projekci (VIP). Pro všechny VIP ≥1 bude jako potenciální cíl vybrán odpovídající iontový profil. Ty budou porovnány s dříve implikovanými metabolity indikujícími IPA (10,11) a také s naší existující databází, jak je shrnuto v PŘÍLOZE A. Taková identifikace je zásadní, protože stejná hodnota m/z může odpovídat různým metabolitům, protože různé látky může mít stejný poměr náboje v zárodečné plazmě. Dále budou všechny identifikované látky potvrzeny podle National Institute of Standards and Technology (NIST) 11 Mass Spectral Library (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) a čistého chemického standardu. Nakonec bude digitální matice složená z vybraných charakteristických těkavých organických látek importována do pythonu (verze 3.10.5 nebo novější) za účelem konstrukce různých klasifikačních modelů s prediktivními výkony hodnocenými binární logistickou regresí. Korelace mezi hladinami exprese VOC ve vydechovaném dechu a hladinami séra a BAL d-gallaktomannanu a diagnostické jistoty IPA (potvrzené, pravděpodobné nebo možné, jak je definováno níže) budou provedeny pomocí Person's r.

Velikost vzorku a výkon:

V této prospektivní longitudinální studii budou při diagnóze zařazeni pacienti s vysokou pravděpodobností rozvoje IPA (tj. pacienti s diagnózou akutní leukémie). Vzhledem k tomu, že naše centrum provádí základní CT screening hrudníku k identifikaci potenciální IPA na začátku, VOC odebrané po normální radiografii mohou sloužit jako dostatečné kontroly. Nejméně u 15 % těchto pacientů se v následujících měsících rozvine IPA (3), což omezuje velikost vzorku potřebnou při náboru. Na základě dříve hlášené adherence ke sledování(12) očekáváme, že míra vynechání bude nízká, což umožní detekci dříve nepolapitelných změn po léčbě v profilech VOC.

Pro účely těchto výpočtů jsme předpokládali dříve uváděnou citlivost testů VOC (ve srovnání s mikrobiologií nebo testováním antigenů v respiračních sekretech, BAL nebo séru pacienta) 80-95 % každého.(10) Nedávné retrospektivní průzkumy určily incidenci IPA na 5 % při úvodním screeningovém CT a dalších 10 % během počáteční hospitalizace.(3) To se promítá do odhadované velikosti vzorku 124 pacientů, vypočtené za předpokladu akceptované významnosti (alfa = 0,05) a síly (beta = 0,8). S přihlédnutím k odhadovanému 70% zapsání a dalších 15% vyloučení je celková odhadovaná velikost vzorku 208 pacientů. Vzhledem k průměrné roční incidenci 90 nových případů akutní leukémie léčených v naší nemocnici by tento cíl odběru vzorků měl být snadno dosažen během předem stanoveného 30měsíčního období náboru. Očekáváme tedy počet účastníků na 300.

ETICKÉ ÚVAHY Vývoj a zlepšování neinvazivních technik pro identifikaci IPA je cílem různých odborných společností již více než dvě desetiletí. (1,4) Diagnostický nástroj navržený pacienty přináší účastníkům minimální až žádné nepohodlí a potenciální vedlejší účinky a nebezpečí považujeme v této zcela neinvazivní modalitě za zanedbatelné.

Po vytěžení dat budou všechna data zbavena jakékoli identifikace včetně jména, příjmení, IČO, čísla případu, data narození a adresy – vše zničeno po dokončení prvotního vytěžení dat. Data musí být bezpečně uložena na RAS zašifrovaném zařízení SD v rukou PI, čímž se minimalizuje pravděpodobnost, že tato studie ovlivní soukromí dat nebo lékařské tajemství zahrnutých pacientů. Vzhledem k přímému vlivu, který mohou mít výsledky tohoto šetření na management a prognózu těžce nemocných, jsme zjistili, že přínosy této studie převažují nad případnými riziky.

Financování Na tuto studii nebylo dosud poskytnuto žádné externí financování.

Bibliografie

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. Klinický algoritmus pro diagnostiku invazivní plicní aspergilózy u kriticky nemocných pacientů. Am J Respir Crit Care Med. 1. července 2012;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F a kol. Epidemiologie invazivních mykotických onemocnění u hematologických pacientů. Mykózy. březen 2021;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y a kol. Základní počítačová tomografie hrudníku pro časnou diagnostiku invazivní plicní aspergilózy u hematoonkologických pacientů: Prospektivní kohortová studie. Clin Infect Dis. 30. října 2019;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE a kol. Revize a aktualizace konsenzuálních definic invazivních plísňových onemocnění od evropské organizace pro výzkum a léčbu rakoviny a konsorcia studijní skupiny pro vzdělávání a výzkum mykóz. Clin Infect Dis. 12. září 2020;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Nové špičkové diagnostické nástroje pro aspergilózu založené na metabolitech. PLoS Pathog. 7. září 2017;13(9):e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang H-C, Chang C-J, Liang S-K a kol. Zkoumání těkavých organických sloučenin v dechu pro vysoce přesnou předpověď rakoviny plic. Rakovina (Basilej). 21. března 2021; 13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et al. Těkavé organické sloučeniny vyvolané virem jsou detekovatelné ve vydechovaném dechu během plicní infekce. Am J Respir Crit Care Med. 1. listopadu 2021; 204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Predikce astmatu pomocí klinických indexů. Přední Pediatr. 31. července 2019; 7:320.
9. Das S, Pal M. Recenze-Neinvazivní monitorování lidského zdraví analýzou vydechovaného dechu: Komplexní přehled. J Electrochem Soc. 3. února 2020;167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM a kol. Signatura sekundárního metabolitu dechu k diagnostice invazivní aspergilózy. Clin Infect Dis. 15. prosince 2014;59(12):1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y a kol. Vydechované těkavé organické sloučeniny pro identifikaci pacientů s chronickou plicní aspergilózou. Přední Med (Lausanne). 23. září 2021;8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Diagnostická úloha polymerázové řetězové reakce v tekutině z bronchoalveolární laváže pro invazivní plicní aspergilózu u imunokompromitovaných pacientů – retrospektivní kohortová studie. Int J Infect Dis. června 2019;83:20-5.