COV dans les échantillons d'haleine pour le diagnostic de l'IPA

CONTEXTE Le diagnostic d'aspergillose pulmonaire invasive (IPA) a de graves implications pour le pronostic et le plan de traitement du patient immunodéprimé. L'omniprésence d'Aspergillus spp dans l'environnement, et par extension - l'ubiquité de tels isolats dans le système respiratoire de sujets sains, pose un grand défi diagnostique. À savoir, la différenciation de l'IPA de la colonisation non invasive des voies respiratoires peut être difficile. La forte augmentation de la prévalence des patients immunodéprimés, y compris les tumeurs malignes et les traitements oncologiques, les cellules souches hématopoïétiques et les greffes d'organes solides, ainsi que les médicaments immunomodulateurs, accentue ce dilemme.(1) En particulier, les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM) présentent un risque élevé de développer une IPA, 5 à 15 % de ces patients développant une IPA au cours des 3 premiers mois suivant le diagnostic de LAM.(1-3) Comme jusqu'à 5 % des patients atteints de LMA peuvent avoir de l'IPA lors de la présentation, les patients admis au Rambam Medical Center (RMC) avec un nouveau diagnostic de LMA subissent systématiquement une tomodensitométrie (TDM) thoracique, qui sert de dépistage de la présence d'IPA au moment du diagnostic. et une ligne de base pour référence ultérieure si l'IPA est suspectée plus tard.(3) Le diagnostic d'IPA probable ou avéré chez un patient atteint de LAM nécessite des résultats d'imagerie suggestifs ainsi que des preuves microbiologiques. Alors que dans certains cas, le diagnostic peut être posé à l'aide de biomarqueurs (principalement l'antigène d-galactomannane et/ou la réaction en chaîne par polymérase d'Aspergillus spp) dans le sang périphérique, la sensibilité de ces tests est faible et souvent cette approche peu invasive ne donne pas une certitude diagnostique suffisante. Dans de tels cas, une bronchoscopie avec lavage bronchoalvéolaire est généralement réalisée. Cette procédure invasive est particulièrement dangereuse chez les patients suspects d'IPA, dont la grande majorité sont très fragiles en raison de leur maladie sous-jacente.(4) Ces considérations ont conduit à la recherche de modalités supplémentaires non invasives dans le diagnostic de l'IPA. (5) L'une de ces approches a été l'analyse des composés organiques volatils (COV) dans des échantillons d'air expiré. Caractérisée par une faible pression de vapeur à température ambiante, l'analyse du profil de COV de l'air expiré est un domaine émergent du diagnostic, avec le potentiel de dépistage et de diagnostic non invasif de diverses maladies, y compris les néoplasmes(6), les infections(7) et les processus inflammatoires. (8) Des études antérieures ont identifié des marqueurs COV potentiels d'Aspergillus spp métaboliquement actifs(9), avec une petite étude prospective chez l'homme(10) montrant des performances diagnostiques encourageantes pour l'identification de l'IPA basée sur les COV. Cependant, ces tentatives ont été entravées par plusieurs écueils. Premièrement, les profils de COV d'Aspergillus spp in vitro semblent avoir peu de relation avec les COV trouvés dans l'analyse de l'haleine des patients colonisés.(5) Deuxièmement, les COV expirés ont tendance à différer considérablement d'un individu à l'autre, ce qui rend l'absence de contrôles temporels (c'est-à-dire les changements de profil de COV chez le même individu avant et après le développement de l'IPA) une mise en garde cruciale. Troisièmement, à notre connaissance, aucune étude longitudinale n'a évalué la réponse des profils de COV au traitement à l'IPA.

Dans cette étude longitudinale prospective, nous visons à surmonter ces obstacles en tirant parti de deux caractéristiques clés des patients hématologiques traités en RMC. Premièrement, les patients atteints de LAM nouvellement diagnostiquée ont une prévalence relativement élevée d'IPA. Deuxièmement, un scanner thoracique est réalisé au diagnostic de LAM chez tous les patients. Ainsi, la collecte d'échantillons d'haleine de patients avec un CT de base normal servira de témoins négatifs, permettant la comparaison des profils de COV avant et après le développement de l'IPA chez le même patient. Un échantillonnage supplémentaire après que le patient a récupéré de l'IPA fournira un contrôle longitudinal supplémentaire.

OBJECTIFS L'identification des profils de COV prédictifs de l'IPA dans les échantillons d'haleine

MÉTHODES

Étudier le design:

Il s'agit d'une étude de cohorte prospective monocentrique, non randomisée. Des échantillons d'haleine de patients consentants seront analysés pour les profils de COV au moment du dépistage initial par tomodensitométrie pour l'IPA. De plus, des échantillons seront également prélevés au moment du diagnostic de toute IPA possible, probable ou confirmée (définie selon les critères de l'EORTC (4) comme détaillé ci-dessous).

Cadre et participants :

Les patients nouvellement diagnostiqués avec une LAM débutant un traitement dans le service d'hématologie du CMR seront approchés. La période d'inclusion sera du 1er octobre 2022 au 31 mars 2025.

Critère d'intégration:

Nouveau diagnostic de leucémie myéloïde aiguë ET/OU transplantation planifiée de cellules souches hématopoïétiques (HCT) CT thoracique effectué dans les 30 jours suivant l'échantillonnage 18 ans ou plus La capacité de fournir des échantillons d'haleine de marée totalisant 10L directement dans un sac Tedlar

Critère d'exclusion:

Toute condition altérant la capacité du patient à donner son consentement éclairé

Collecte d'échantillons:

Les échantillons d'haleine seront prélevés dans l'une des 23 chambres d'hospitalisation dédiées de notre service d'hématologie - à pression positive et à température contrôlée avec des filtres à particules à haute efficacité E-pure (HEPA) (ADS-Laminaire, Israël). Les patients devront s'abstenir de se brosser les dents, de se laver les dents, de manger, de boire ou de fumer dans les 6 heures précédant le prélèvement de l'échantillon. Après avoir été assis pendant 10 minutes (pour éviter l'augmentation de la concentration d'isoprène induite par l'exercice (11) ), le patient sera invité à remplir 10 L d'haleine de marée dans un sac en tedlar (SKC, Corée du Sud). Simultanément, un sac tedlar identique doit être rempli d'air ambiant.

Lors de chaque prélèvement d'échantillon, les données suivantes seront enregistrées :

Caractéristiques du patient, y compris l'âge, le diagnostic hémato-oncologique, le délai depuis le diagnostic initial, le traitement en cours, le délai depuis le HCT le cas échéant, les diagnostics de fond Traitement pharmacologique actuel, y compris tous les antibiotiques et antifongiques prescrits le mois précédent.

Tests de diagnostic actuels, y compris toutes les cultures, les tests sérologiques, les études d'amplification des acides nucléiques, la formule sanguine complète et la chimie, le taux plasmatique de voriconazole et l'imagerie thoracique effectués au cours du mois précédent.

Manipulation des échantillons et extraction des COV :

Tous les sacs tedlar seront stockés à 4℃ après la collecte. L'adsorption sur 2 tubes de désorption thermique parallèles doit être réalisée via la pompe d'échantillonnage d'air personnelle à faible débit Gilian LFS-113 (instruments SRA, Milano, Italie), effectuée dans les 72 heures suivant l'échantillonnage et stockée dans des conditions ambiantes. Ces échantillons seront étiquetés (codés) et transformés au laboratoire de chimie environnementale (Kasali Institute of Chemistry, Hebrew University of Jerusalem, Israel)

Analytique:

La désorption thermique sera accomplie à 290 pendant 20 minutes en utilisant de l'hélium gazeux de qualité analytique (99,999 %) comme vecteur. L'injection vers la spectroscopie de masse par chromatographie en phase gazeuse en tandem (GC-MS) doit être effectuée à des températures d'entrée similaires ne dépassant pas le débit de 40 mL/min. Le programme de température initial du GC imitera les protocoles précédemment rapportés (10) : 40 °C pendant 3 minutes, augmenté à 70 °C à un rythme de 5 °C par minute et maintenu pendant 3 minutes, augmenté à 203 °C à 7 °C par minute et maintenu pendant 4 minutes, porté rapidement à 270°C et maintenu pendant 5 minutes. Un spectromètre de masse triple quadruple (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) doit être connecté en tandem, avec une plage de mesure de masse de 20 à 400 m/z.

Le diagnostic d'aspergillose pulmonaire invasive sera défini selon les critères EORTC mis à jour (4) comme l'un des éléments suivants :

IPA confirmée définie comme un échantillon de biopsie respiratoire avec culture positive d'Aspergillus spp ou démonstration histopathologique d'invasion tissulaire par les hyphes.

"IPA probable", définie (1) comme des caractéristiques radiographiques compatibles sur le scanner thoracique (lésion(s) dense(s) bien circonscrite(s) avec ou sans signe de halo, signe de croissant d'air ou cavité) et l'un des éléments suivants : Preuve d'Aspergillus spp lors d'une cytologie, d'une microscopie directe ou d'une culture à partir de tout échantillon respiratoire, y compris les crachats, le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL) ou la brosse bronchique Antigène D-galactomannane positif détecté dans le plasma, le sérum ou le liquide BAL Réaction en chaîne par polymérase (PCR) positive pour Aspergillus spp détecté dans le plasma, le sérum ou le liquide BAL "IPA possible", définie (1) comme des caractéristiques radiographiques compatibles sur le scanner thoracique (Lésion(s) dense(s) bien circonscrite(s) avec ou sans signe de halo, signe de croissant d'air ou cavité ) sans résultats de laboratoire corroborants.

Des informations supplémentaires concernant la probabilité de diagnostic d'IPA seront recueillies par deux observateurs indépendants (I.G. et A.S.) examinant le dossier médical électronique complet (DME) à la fin de la période d'étude, en attribuant un score de probabilité unique de 1 à 10 (1 étant très faible probabilité d'IPA, 10 correspondant à une IPA presque certaine) compte tenu de l'évolution clinique complète de la maladie.

Variables et sources de données supplémentaires : pour tous les patients de la cohorte, les informations épidémiologiques et cliniques seront extraites du système de dossiers médicaux électroniques (DME) de l'hôpital utilisé dans notre hôpital, récupérées à l'aide du logiciel MD-clone. Nous aurons besoin d'obtenir les informations personnelles des patients afin d'accéder à leurs données enregistrées dans le suivi quotidien dans leur dossier médical car certaines données ne sont pas cryptées. Toutes les données seront ensuite codées et supprimées de tout identifiant personnel, y compris le nom, le prénom, la date de naissance, le numéro d'identification et l'adresse. Toutes les données doivent être stockées sur un disque dur désigné entre les mains de l'investigateur principal. Les sources de données comprendront le dossier du patient sur le registre DME "prometheus" ainsi que les données récupérées à l'aide du logiciel MD-clone. Les données recueillies comprendront : les données démographiques (âge, sexe), les diagnostics de fond, la durée du séjour et le transfert vers d'autres unités, les résultats de laboratoire, les signes vitaux enregistrés et la méthode d'oxygénation utilisée telle que documentée dans le suivi quotidien.

Calendrier de prélèvement des échantillons : le premier échantillon de patients consentants inclus dans cette étude sera prélevé dans les 7 jours suivant le scanner thoracique initial. Par la suite, suite à toute suspicion clinique d'IPA par le médecin traitant - une suspicion qui conduit invariablement à la réalisation d'un scanner thoracique, des échantillons seront prélevés dans les 7 jours suivant le scanner thoracique. Des échantillons supplémentaires seront prélevés dans les 7 jours suivant l'arrêt du traitement antifongique par le médecin traitant. Le calendrier d'échantillonnage, sont visualisés dans la figure 1.

Figure 1 - Stratégie d'échantillonnage. L'intervention de cette étude se limite à l'échantillonnage souligné en rouge gras - toutes les autres étapes font partie de la prise en charge habituelle des patients atteints de LAM et ne sont en aucun cas affectées par la participation à cette étude. LAM - leucémie myéloïde aiguë ; Dx - Diagnostic ; CT - Tomographie informatisée ; IPA - Aspergillose pulmonaire invasive ; Tx - Traitement ; d/c - discontinué ; GGO - Opacités du verre dépoli.

Traitement des données et analyse statistique :

Les données cliniques doivent être analysées à l'aide de statistiques descriptives, de tests paramétriques et non paramétriques, selon le cas. Toutes les analyses statistiques doivent être effectuées à l'aide du logiciel R version 4.0.0 ("Arbor day") ou ultérieure. Toutes les données identifiables, y compris les caractéristiques de base du patient, les résultats de laboratoire et d'imagerie et les diagnostics et dossiers de traitement antérieurs, doivent être stockées par l'investigateur principal sur un dispositif de mémoire en phase solide crypté RAS désigné pendant la durée de l'étude. Les noms, numéros d'identification, adresse et date de naissance des patients ne seront pas stockés.

Les sorties de spectroscopie de masse seront examinées à l'aide de la station de travail et du logiciel MassHunter (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). L'analyse de discrimination des moindres carrés partiels sera effectuée à l'aide du logiciel SIMCA version 14.0 ou ultérieure (MKS Umetrics, Suède). Pour chaque plage m/z, un modèle de régression logistique sera construit, permettant le calcul de l'importance variable pour la projection (VIP). Pour tous les VIP ≥1, le profil ionique correspondant sera sélectionné comme cible potentielle. Ceux-ci seront comparés aux métabolites précédemment impliqués indicatifs de l'IPA, (10,11) ainsi qu'à notre base de données existante, comme résumé dans l'ANNEXE A. Une telle identification est cruciale car la même valeur m/z peut correspondre à différents métabolites, car différentes substances peuvent avoir le même rapport de charge germoplasme. Ensuite, toutes les substances identifiées seront confirmées par rapport à la bibliothèque de spectres de masse 11 du National Institute of Standards and Technology (NIST) (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) et à un étalon chimique pur. Enfin, la matrice numérique composée des COV caractéristiques sélectionnés sera importée en python (version 3.10.5 ou ultérieure) pour construire différents modèles de classification, avec des performances prédictives évaluées par régression logistique binaire. Les corrélations entre les niveaux d'expression de COV dans l'air expiré et les niveaux de d-gallactomannane sérique et de BAL et la certitude diagnostique de l'IPA (confirmé, probable ou possible, tel que défini ci-dessous) seront réalisées à l'aide du r de la personne.

Taille et puissance de l'échantillon :

Dans cette étude longitudinale prospective, les patients présentant une forte probabilité de développer une IPA (c'est-à-dire les patients diagnostiqués avec une leucémie aiguë) seront recrutés au moment du diagnostic. Étant donné que notre centre effectue un dépistage par tomodensitométrie thoracique de base pour identifier l'IPA potentiel au départ, les COV collectés après une radiographie normale peuvent servir de contrôles suffisants. Au moins 15 % de ces patients développent une IPA dans les mois qui suivent,(3) limitant la taille de l'échantillon nécessaire au recrutement. Sur la base de l'adhésion au suivi rapportée précédemment, (12) nous nous attendons à ce que le taux d'abandon soit faible, permettant la détection de changements post-traitement auparavant insaisissables dans les profils de COV.

Aux fins de ces calculs, nous avons supposé la sensibilité des tests de COV précédemment signalés (par rapport à la microbiologie ou aux tests d'antigène dans les sécrétions respiratoires, le LBA ou le sérum du patient) de 80 à 95 % chacun.(10) Des enquêtes rétrospectives récentes ont identifié l'incidence de l'IPA comme étant de 5 % lors du dépistage initial par TDM et de 10 % supplémentaires lors de l'hospitalisation initiale.(3) Cela se traduit par une taille d'échantillon estimée de 124 patients, calculée sous l'hypothèse de la signification acceptée (alpha = 0,05) et de la puissance (bêta = 0,8). Compte tenu d'un taux d'inscription estimé à 70 % et d'un taux d'exclusion supplémentaire de 15 %, la taille totale estimée de l'échantillon est de 208 patients. En projetant l'incidence annuelle moyenne de 90 nouveaux cas de leucémie aiguë traités dans notre hôpital, cet objectif d'échantillonnage devrait être facilement atteint dans la période de recrutement prédéfinie de 30 mois. On s'attend donc à ce que le nombre de participants soit de 300.

CONSIDÉRATIONS ÉTHIQUES Le développement et l'amélioration de techniques non invasives pour l'identification de l'IPA ont été l'objectif déclaré de diverses sociétés professionnelles depuis plus de deux décennies. (1,4) L'outil de diagnostic proposé par les patients ne présente que peu ou pas d'inconvénients pour les participants, et nous estimons que les effets secondaires potentiels et le danger sont négligeables dans cette modalité entièrement non invasive.

Après l'extraction des données, toutes les données doivent être dépouillées de toute identification, y compris le nom, le prénom, le numéro d'identification, le numéro de dossier, la date de naissance et l'adresse - toutes détruites lorsque l'extraction initiale des données est terminée. Les données doivent être stockées en toute sécurité sur un dispositif SD désigné crypté RAS entre les mains du PI, minimisant la probabilité que cette étude affecte la confidentialité des données ou la confidentialité médicale des patients inclus. Compte tenu de l'effet direct que les résultats de cette enquête peuvent avoir sur la prise en charge et le pronostic des personnes gravement malades, nous estimons que les avantages de cette étude l'emportent sur les risques potentiels.

Financement Aucun financement externe n'a été fourni pour cette étude jusqu'à présent.

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