VOC i pusteprøver for diagnostisering av IPA

BAKGRUNN Diagnosen invasiv pulmonal aspergillose (IPA) har alvorlige implikasjoner for prognosen og behandlingsplanen til den immunsupprimerte pasienten. Den allestedsnærværende tilstedeværelsen av Aspergillus spp i miljøet, og i forlengelsen - allestedsnærværende av slike isolater i luftveiene til friske personer, utgjør en stor diagnostisk utfordring. Nemlig differensieringen av IPA fra ikke-invasiv kolonisering av luftveiene, kan være utfordrende. Den enorme økningen i prevalensen av pasienter som er immunsupprimerte, inkludert maligniteter og onkologiske behandlinger, hematopoietiske stamceller og solide organtransplantasjoner, og immunmodulerende medisiner, fremhever dette dilemmaet.(1) Spesielt pasienter med akutt myelogen leukemi (AML) har høy risiko for å utvikle IPA, med 5-15 % av slike pasienter som utvikler IPA i løpet av de første 3 månedene etter AML-diagnose.(1-3) Ettersom opptil 5 % av pasientene med AML kan ha IPA ved presentasjonen, gjennomgår pasienter innlagt på Rambam Medical Center (RMC) med en ny diagnose av AML rutinemessig brysttomografi (CT), som fungerer som screening for tilstedeværelse av IPA ved diagnose og en grunnlinje for videre referanse dersom IPA mistenkes senere.(3) Diagnostisering av sannsynlig eller påvist IPA hos en AML-pasient krever suggestive avbildningsfunn sammen med mikrobiologiske bevis. Mens diagnosen i noen tilfeller kan stilles ved bruk av biomarkører (hovedsakelig d-galactomannan-antigenet og eller Aspergillus spp-polymerasekjedereaksjon) i perifert blod, er sensitiviteten til disse analysene lav og ofte gir ikke denne minimalt invasive tilnærmingen tilstrekkelig diagnostisk sikkerhet. I slike tilfeller utføres vanligvis bronkoskopi med bronkoalveolar lavage. Denne invasive prosedyren er spesielt farlig hos pasienter med mistanke om IPA, hvorav de aller fleste er svært skrøpelige på grunn av sin underliggende sykdom.(4) Disse betraktningene har ledet søken etter ytterligere, ikke-invasive modaliteter ved diagnostisering av IPA. (5) En slik tilnærming har vært analyse av flyktige organiske forbindelser (VOC) i utåndede luftprøver. Karakterisert av lavt damptrykk ved romtemperatur, er VOC-profilanalyse av utåndet luft et voksende felt innen diagnostikk, med potensial for ikke-invasiv screening og diagnostisering av ulike sykdommer, inkludert neoplasmer,(6) infeksjoner(7) og inflammatoriske prosesser. (8) Tidligere studier har identifisert potensielle VOC-markører for metabolsk aktive Aspergillus spp,(9) med en liten prospektiv studie på mennesker(10) som viser oppmuntrende diagnostisk ytelse for VOC-basert IPA-identifikasjon. Disse forsøkene har imidlertid blitt hindret av flere fallgruver. For det første ser VOC-profiler av in vitro Aspergillus spp ut til å ha liten sammenheng med VOC funnet i pusteanalyse av koloniserte pasienter.(5) For det andre har utåndede VOC-er en tendens til å variere sterkt mellom individer, noe som gjør fraværet av tidsmessige kontroller (dvs. VOC-profilendringer hos samme individ før og etter IPA-utvikling) til et avgjørende forbehold.(10) For det tredje, så vidt vi vet, har ingen longitudinelle studier vurdert responsen til VOC-profiler på IPA-behandling.

I denne prospektive longitudinelle studien tar vi sikte på å overvinne disse hindringene ved å dra nytte av to nøkkelegenskaper til hematologiske pasienter behandlet i RMC. For det første har pasienter med nylig diagnostisert AML en relativt høy prevalens av IPA. For det andre utføres en bryst-CT ved diagnosen AML hos alle pasienter. Dermed vil innsamling av pusteprøver fra pasienter med normal baseline CT tjene som negative kontroller, noe som gjør det mulig å sammenligne VOC-profiler før og etter utviklingen av IPA hos samme pasient. Ytterligere prøvetaking etter at pasienten er blitt frisk etter IPA vil gi ytterligere longitudinell kontroll.

MÅL Identifikasjon av VOC-profiler som forutsier IPA i pusteprøver

METODER

Studere design:

Dette er en enkeltsenter, ikke-randomisert, prospektiv kohortstudie. Pusteprøver fra samtykkende pasienter vil bli analysert for VOC-profiler på tidspunktet for første CT-screening for IPA. I tillegg vil det også bli samlet inn prøver på tidspunktet for diagnose av enhver mulig, sannsynlig eller bekreftet IPA (definert i henhold til EORTC-kriteriene (4) som beskrevet nedenfor).

Innstilling og deltakere:

Pasienter som er nylig diagnostisert med AML som starter behandling på RMC hematologisk avdeling vil bli kontaktet. Inkluderingsperioden vil være fra 1. oktober 2022 til 31. mars 2025.

Inklusjonskriterier:

Ny diagnose av akutt myeloid leukemi OG/ELLER planlagt hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HCT) Bryst-CT utført innen 30 dager fra prøvetaking 18 år eller eldre Evnen til å gi tidevannspusteprøver på totalt 10L direkte i en Tedlar-pose

Ekskluderingskriterier:

Enhver tilstand som svekker pasientens evne til å gi informert samtykke

Prøvesamling:

Pusteprøver vil bli samlet inn i en av vår hematologiske avdelings 23 dedikerte sykehusinnleggelsesrom - positivt trykksatt og klimakontrollert med E-rene høyeffektive partikkelluftfiltre (HEPA) (ADS-Laminaire, Israel). Pasienter vil bli pålagt å avstå fra tannpuss, tannvask, spising, drikking eller røyking innen 6 timer før prøvetaking. Etter å ha sittet i 10 minutter (for å unngå økt isoprenkonsentrasjon på grunn av trening (11) ), vil pasienten bli bedt om å fylle 10L tidevannspust i en tedlar-pose (SKC, Sør-Korea). Samtidig skal en identisk tedlar-pose fylles med omgivelsesluft.

Ved hver prøveinnsamling vil følgende data bli registrert:

Pasientens karakteristika, inkludert alder, hemato-onkologisk diagnose, tid fra førstegangsdiagnose, nåværende behandling, tid fra HCT hvis aktuelt, bakgrunnsdiagnoser Gjeldende farmakologisk behandling, inkludert alle antibiotika og soppdrepende midler forskrevet forrige måned.

Gjeldende diagnostiske tester, inkludert alle kulturer, serologiske analyser, nukleinsyreamplifikasjonsstudier, fullstendig blodtelling og kjemi, plasmanivå av vorikonazol og avbildning av brystet utført i løpet av den siste måneden.

Prøvehåndtering og VOC-ekstraksjon:

Alle tedlar-poser vil bli lagret ved 4 ℃ etter innsamling. Adsorpsjon på 2 parallelle termiske desorpsjonsrør skal utføres via Gilian LFS-113 Low Flow Personal Air Sampling Pump (SRA-instrumenter, Milano, Italia), utført innen 72 timer fra prøvetaking og lagret under omgivelsesforhold. Disse prøvene vil bli merket (kodet) og transformert til Environmental Chemistry Laboratory (Kasali Institute of Chemistry, Hebraw University of Jerusalem, Israel)

Analytics:

Termisk desorpsjon vil bli utført ved 290°C i 20 minutter ved bruk av analytisk kvalitet (99,999%) heliumgass som bærer. Injeksjon til tandem gasskromatografi massespektroskopi (GC-MS) skal utføres ved lignende innløpstemperaturer som ikke overstiger strømmen på 40 ml/min. Det første GC-temperaturprogrammet vil etterligne tidligere rapporterte (10) protokoller: 40˚C i 3 minutter, hevet til 70˚C med en hastighet på 5˚C per minutt og holdt i 3 minutter, hevet til 203˚C ved 7˚C minutt og holdt i 4 minutter, hevet raskt til 270˚C og holdt i 5 minutter. Et trippelt quad massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) skal kobles sammen, med et massemålingsområde på 20-400 m/z.

Diagnosen invasiv pulmonal aspergillose vil bli definert i henhold til de oppdaterte EORTC-kriteriene (4) som ett av følgende:

Bekreftet IPA definert som en respiratorisk biopsiprøve med positiv kultur av Aspergillus spp eller histopatologisk demonstrasjon av vevsinvasjon av hyfer.

"Sannsynlig IPA", definert (1) som kompatible radiografiske trekk på bryst-CT (tett, godt omskreven(e) lesjon(er) med eller uten halo-tegn, luft-halvmåne-tegn eller et hulrom) og noen av følgende: Bevis for Aspergillus spp etter cytologi, direkte mikroskopi eller kultur fra alle respirasjonsprøver, inkludert sputum, bronkoalveolær lavage (BAL) væske eller bronkial børste Positivt D-galaktomannan antigen påvist i plasma, serum eller BAL væske Positiv polymerasekjedereaksjon (PCR) for Aspergillus spp påvist i plasma, serum eller BAL-væske "Mulig IPA", definert (1) som kompatible radiografiske trekk på CT-thorax (tett, godt omskrevne lesjon(er) med eller uten halo-tegn, luft-halvmåne-tegn eller et hulrom ) uten bekreftende laboratoriefunn.

Ytterligere informasjon om sannsynligheten for IPA-diagnose vil bli samlet inn av to uavhengige observatører (I.G. og A.S.) som gjennomgår den fullstendige elektroniske medisinske journalen (EMR) ved slutten av studieperioden, og tildeler en enkelt sannsynlighetsscore 1-10 (1 er svært lavt) sannsynlighet for IPA, 10 som tilsvarer nesten sikker IPA) i lys av det fulle kliniske forløpet av sykdommen.

Ytterligere variabler og datakilder: For alle kohortpasienter vil epidemiologisk og klinisk informasjon hentes ut fra sykehusets elektroniske journalsystem (EMR) som brukes på sykehuset vårt hentet ved hjelp av MD-clone-programvaren. Vi må innhente personopplysninger om pasienter for å få tilgang til dataene deres registrert i den daglige oppfølgingen i deres medisinske kart, da noen data ikke er kodet. Alle data skal senere kodes og fjernes fra eventuelle personlige identifikatorer, inkludert navn, etternavn, fødselsdato, ID-nummer og adresse. Alle data skal lagres på en angitt harddisk hos hovedetterforskeren. Datakilder vil inkludere pasientens fil på "prometheus" EMR-registeret samt hentede data ved hjelp av MD-klonprogramvare. Innsamlede data vil omfatte: demografi (alder, kjønn), bakgrunnsdiagnoser, liggetid og overføring til andre enheter, laboratorieresultater, registrerte vitale tegn og oksygeneringsmetoden som er brukt som dokumentert i den daglige oppfølgingen.

Prøvesamlingsplan: Den første utvalget av samtykkende pasienter inkludert i denne studien vil bli samlet inn innen 7 dager fra baseline thorax-CT. Deretter, etter enhver klinisk mistanke om IPA av behandlende lege - en mistanke som alltid fører til at en bryst-CT blir utført, vil prøver bli samlet inn innen 7 dager fra bryst-CT. Ytterligere prøver vil bli samlet inn innen 7 dager etter seponering av antifungal behandling av behandlende lege. Prøvetakingsplanen er visualisert i figur 1.

Figur 1 - Prøvetakingsstrategi. Denne studiens intervensjon er begrenset til prøvetaking understreket med fet rødt - alle andre trinn er en del av den vanlige behandlingen av AML-pasienter og er på ingen måte påvirket av deltakelsen i denne studien. AML - Akutt Myeloid Leukemi; Dx - Diagnose; CT - Datastyrt tomografi; IPA - Invasiv lunge aspergillose; Tx - Behandling; d/c - avviklet; GGO - Ground Glass Opacities.

Datahåndtering og statistisk analyse:

Kliniske data skal analyseres ved hjelp av beskrivende statistikk, parametriske og ikke-parametriske tester etter behov. All statistisk analyse skal utføres med R-programvareversjon 4.0.0 ("Arbor day") eller senere. Alle identifiserbare data, inkludert pasientens grunnlinjekarakteristikker, laboratorie- og bilderesultater og tidligere diagnoser og behandlingsjournaler, skal lagres av primæretterforskeren på en utpekt RAS-kryptert fastfaseminneenhet i løpet av studien. Pasientens navn, ID-nummer, adresse og fødselsdato vil ikke bli lagret.

Massespektroskopi-utdata vil bli vurdert ved hjelp av MassHunter-arbeidsstasjonen og programvaren (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Delvis minste kvadraters diskrimineringsanalyse vil bli utført ved å bruke SIMCA-programvaren versjon 14.0 eller senere (MKS Umetrics, Sverige). For hvert m/z-område vil det bli konstruert en logistisk regresjonsmodell som gjør det mulig å beregne den variable betydningen for projeksjon (VIP). For alle VIP-er ≥1 vil den tilsvarende ioneprofilen bli valgt som et potensielt mål. Disse vil bli sammenlignet med tidligere impliserte metabolitter som indikerer IPA, (10,11) samt vår eksisterende database, som oppsummert i APPENDIKS A. Slik identifikasjon er avgjørende siden samme m/z-verdi kan tilsvare ulike metabolitter, som ulike stoffer. kan ha samme kimplasmaladningsforhold. Deretter vil alle identifiserte stoffer bekreftes mot National Institute of Standards and Technology (NIST) 11 Mass Spectral Library (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) og en ren kjemisk standard. Til slutt vil den digitale matrisen som består av de utvalgte karakteristiske VOC-ene importeres til python (versjon 3.10.5 eller nyere) for å konstruere forskjellige klassifiseringsmodeller, med prediktive ytelser vurdert ved binær logistisk regresjon. Korrelasjonene mellom utåndet VOC-ekspresjonsnivåer og nivåer av serum og BAL d-galaktomannan og IPA diagnostisk sikkerhet (bekreftet, sannsynlig eller mulig, som definert nedenfor) vil bli oppnådd ved å bruke Persons r.

Prøvestørrelse og kraft:

I denne prospektive longitudinelle studien vil pasienter med høy sannsynlighet for å utvikle IPA (dvs. pasienter diagnostisert med akutt leukemi) bli registrert ved diagnosen. Siden vårt senter utfører baseline CT-screening for brystet for å identifisere potensiell IPA ved baseline, kan VOC samlet etter normal radiografi tjene som rikelig kontroll. Minst 15 % av slike pasienter fortsetter å utvikle IPA i de påfølgende månedene,(3), noe som begrenser prøvestørrelsen som trengs ved rekruttering. Basert på tidligere rapportert overholdelse av oppfølging (12) forventer vi at frafallsraten er lav, noe som gjør det mulig å oppdage tidligere unnvikende endringer etter behandling i VOC-profiler.

For formålet med disse beregningene antok vi den tidligere rapporterte VOC-analysesensitiviteten (sammenlignet med mikrobiologi eller antigentesting i respirasjonssekret, BAL eller pasientserum) på 80-95 % hver.(10) Nyere retrospektive undersøkelser har identifisert forekomsten av IPA til å være 5 % ved første screening CT og ytterligere 10 % innen den første sykehusinnleggelsen.(3) Dette gir en estimert prøvestørrelse på 124 pasienter, beregnet under antakelsen om akseptert signifikans (alfa = 0,05) og kraft (beta = 0,8). Tillater det anslagsvis 70 % påmelding og den ekstra eksklusjonsraten på 15 %, er den totale estimerte prøvestørrelsen 208 pasienter. Ved å anslå den gjennomsnittlige årlige forekomsten av 90 nye tilfeller av akutt leukemi behandlet på sykehuset vårt, bør dette prøvetakingsmålet lett nås innen den forhåndsspesifiserte rekrutteringsperioden på 30 måneder. Vi forventer dermed at antall deltakere blir 300.

ETISKE HENSYN Utvikling og forbedring av ikke-invasive teknikker for IPA-identifikasjon har vært det uttalte målet for ulike profesjonelle samfunn i over to tiår. (1,4) Pasientens foreslåtte diagnostiske verktøy har minimal eller ingen ulempe for deltakerne, og vi anser potensielle bivirkninger og fare for å være ubetydelig i denne fullstendig ikke-invasive modaliteten.

Etter datauttrekking skal alle data fratas all identifikasjon, inkludert navn, etternavn, ID-nummer, saksnummer, fødselsdato og adresse – alt tilintetgjort når den første datautvinningen er fullført. Data skal lagres sikkert på en RAS-kryptert, utpekt SD-enhet i hendene av PI, noe som minimerer sannsynligheten for at denne studien påvirker personvernet eller medisinsk konfidensialitet til pasientene inkludert. I lys av den direkte effekten resultatene av denne undersøkelsen kan ha på ledelsen og prognosen til alvorlig syke, finner vi at fordelene med denne studien oppveier enhver potensiell risiko.

Finansiering Det er ikke gitt ekstern finansiering til denne studien så langt.

Bibliografi

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et al. En klinisk algoritme for å diagnostisere invasiv pulmonal aspergillose hos kritisk syke pasienter. Am J Respir Crit Care Med. 1. juli 2012;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et al. Epidemiologi av invasiv soppsykdom hos hematologiske pasienter. Mykoser. 2021 Mar;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y, et al. Baseline Chest Computed Tomography for tidlig diagnose av invasiv pulmonal aspergillose hos hemato-onkologiske pasienter: en prospektiv kohortstudie. Clin Infect Dis. 2019 30. oktober;69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et al. Revisjon og oppdatering av konsensusdefinisjonene av invasiv soppsykdom fra den europeiske organisasjonen for forskning og behandling av kreft og mycoses studiegruppe utdanning og forskningskonsortium. Clin Infect Dis. 12. september 2020;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Nye banebrytende metabolittbaserte diagnostiske verktøy for aspergillose. PLoS Pathog. 7. september 2017;13(9):e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang H-C, Chang C-J, Liang S-K, et al. Utforsker flyktige organiske forbindelser i pusten for høy nøyaktighet forutsigelse av lungekreft. Kreft (Basel). 21. mars 2021;13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et al. Virusinduserte flyktige organiske forbindelser kan påvises i utåndet pust under lungeinfeksjon. Am J Respir Crit Care Med. 1. november 2021;204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Forutsi astma ved hjelp av kliniske indekser. Front Pediatr. 31. juli 2019; 7:320.
9. Das S, Pal M. Review-Non-Invasive Monitoring of Human Health by Exhaled Breath Analysis: A Comprehensive Review. J Electrochem Soc. 3. februar 2020;167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM, et al. En sekundær metabolittsignatur for pustesopp for å diagnostisere invasiv aspergillose. Clin Infect Dis. 2014 15. desember;59(12):1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y, et al. Utåndede flyktige organiske forbindelser for å identifisere pasienter med kronisk pulmonal aspergillose. Front Med (Lausanne). 23. september 2021; 8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Diagnostisk rolle av polymerasekjedereaksjon i bronchoalveolar lavage fluid for invasiv pulmonal aspergillose hos immunkompromitterte pasienter - En retrospektiv kohortstudie. Int J Infect Dis. juni 2019;83:20-5.