VOC hengitysnäytteissä IPA:n diagnosointiin

TAUSTA Invasiivisen keuhkoaspergilloosin (IPA) diagnoosilla on vakavia seurauksia immunosuppressoituneen potilaan ennusteeseen ja hoitosuunnitelmaan. Aspergillus spp:n kaikkialla esiintyminen ympäristössä ja sitä kautta tällaisten isolaattien läsnäolo terveiden koehenkilöiden hengityselimistössä on suuri diagnostinen haaste. Nimittäin IPA:n erottaminen ei-invasiivisesta hengitysteiden kolonisaatiosta voi olla haastavaa. Immunosuppressoituneiden potilaiden esiintyvyys, mukaan lukien pahanlaatuiset kasvaimet ja onkologiset hoidot, hematopoieettiset kantasolut ja kiinteät elinsiirrot sekä immunomoduloivat lääkkeet, korostaa tätä ongelmaa.(1) Erityisesti potilailla, joilla on akuutti myelooinen leukemia (AML), on suuri riski saada IPA:ta, ja 5–15 %:lle näistä potilaista kehittyy IPA ensimmäisten kolmen kuukauden aikana AML-diagnoosin jälkeen (1–3). Koska jopa 5 %:lla AML-potilaista voi esiintyä IPA:ta, Rambam Medical Centeriin (RMC) otetuille potilaille, joilla on uusi AML-diagnoosi, tehdään rutiininomaisesti rintakehän tietokonetomografia (CT), joka toimii IPA-seulonnana diagnoosin yhteydessä. ja lähtökohta lisäviittauksille, jos IPA:ta epäillään myöhemmin.(3) Todennäköisen tai todistetun IPA:n diagnoosi AML-potilaalla edellyttää viittaavia kuvantamislöydöksiä sekä mikrobiologista näyttöä. Vaikka joissakin tapauksissa diagnoosi voidaan tehdä käyttämällä perifeerisessä veressä olevia biomarkkereita (pääasiassa d-galaktomannaaniantigeenia ja/tai Aspergillus spp -polymeraasiketjureaktiota), näiden määritysten herkkyys on alhainen ja usein tämä minimaalisesti invasiivinen lähestymistapa ei anna riittävää diagnostista varmuutta. Tällaisissa tapauksissa suoritetaan yleensä bronkoskoopia bronkoalveolaarisella huuhtelulla. Tämä invasiivinen toimenpide on erityisen vaarallinen potilaille, joilla on epäilty IPA:ta ja joista suurin osa on hyvin heikkoja taustasairaudensa vuoksi.(4) Nämä näkökohdat ovat johtaneet etsimään muita, ei-invasiivisia tapoja IPA:n diagnosointiin. (5) Yksi tällainen lähestymistapa on ollut haihtuvien orgaanisten yhdisteiden (VOC) analyysi uloshengitetyn ilman näytteistä. Alhainen höyrynpaine huoneenlämpötilassa luonnehtii uloshengitetyn ilman VOC-profiilianalyysiä, joka on nouseva diagnostiikan ala, joka mahdollistaa ei-invasiivisen seulonnan ja eri sairauksien diagnosoinnin, mukaan lukien kasvaimet,(6) infektiot(7) ja tulehdusprosessit. (8) Aiemmissa tutkimuksissa on tunnistettu metabolisesti aktiivisten Aspergillus spp:n potentiaalisia VOC-markkereita (9), ja yksi pieni prospektiivinen tutkimus ihmisillä (10) osoitti rohkaisevaa diagnostista suorituskykyä VOC-pohjaisessa IPA-tunnistuksessa. Näitä yrityksiä ovat kuitenkin haitanneet useat sudenkuopat. Ensinnäkin Aspergillus spp:n in vitro VOC-profiileilla näyttää olevan vähän yhteyttä VOC-yhdisteisiin, jotka on löydetty kolonisoituneiden potilaiden hengitysanalyysissä.(5) Toiseksi uloshengitetyt VOC-yhdisteet vaihtelevat suuresti yksilöiden välillä, joten ajallisten kontrollien puuttuminen (eli VOC-profiilin muutokset samassa yksilössä ennen IPA:n kehitystä ja sen jälkeen) on tärkeä varoitus(10). Kolmanneksi tietojemme mukaan mikään pitkittäistutkimus ei ole arvioinut VOC-profiilien vastetta IPA-hoitoon.

Tässä prospektiivisessa pitkittäistutkimuksessa pyrimme voittamaan nämä esteet hyödyntäen kahta keskeistä RMC:ssä hoidettujen hematologisten potilaiden ominaisuutta. Ensinnäkin potilailla, joilla on äskettäin diagnosoitu AML, on suhteellisen korkea IPA: n esiintyvyys. Toiseksi kaikille potilaille tehdään rintakehän CT AML-diagnoosin yhteydessä. Näin ollen hengitysnäytteiden kerääminen potilailta, joilla on normaali lähtötilanteen CT, toimii negatiivisina kontrolleina, mikä mahdollistaa VOC-profiilien vertailun ennen ja jälkeen IPA:n kehittymisen samalla potilaalla. Lisänäytteenotto sen jälkeen, kun potilas on toipunut IPA:sta, tarjoaa lisää pitkittäistä kontrollia.

TAVOITTEET IPA:ta ennustavien VOC-profiilien tunnistaminen hengitysnäytteistä

MENETELMÄT

Opintojen suunnittelu:

Tämä on yhden keskuksen, ei satunnaistettu, prospektiivinen kohorttitutkimus. Suostuneiden potilaiden hengitysnäytteistä analysoidaan VOC-profiilit IPA:n ensimmäisen CT-seulonnan yhteydessä. Lisäksi näytteitä kerätään myös mahdollisen, todennäköisen tai vahvistetun IPA:n (määritelty EORTC-kriteerien (4) mukaisesti, kuten alla on kuvattu) diagnoosin yhteydessä.

Asetus ja osallistujat:

Potilaita, joilla on äskettäin diagnosoitu AML ja jotka aloittavat hoidon RMC:n hematologian osastolla, otetaan yhteyttä. Osallistumisaika alkaa 1.10.2022 ja päättyy 31.3.2025.

Sisällyttämiskriteerit:

Uusi akuutin myelooisen leukemian diagnoosi JA/TAI suunniteltu hematopoieettisten kantasolujen siirto (HCT) Rintakehän TT tehty 30 päivän sisällä näytteenotosta vähintään 18-vuotiaille Kyky toimittaa 10 litran hengityksen hengityksen näytteitä suoraan Tedlar-pussiin

Poissulkemiskriteerit:

Mikä tahansa tila, joka heikentää potilaan kykyä antaa tietoinen suostumus

Näytekokoelma:

Hengitysnäytteet kerätään yhdessä hematologisen osastomme 23:sta omistetusta sairaalahuoneesta – positiivisesti paineistettu ja ilmastoitu E-pure high-efficiency hiukkasilmasuodattimilla (HEPA) (ADS-Laminaire, Israel). Potilaiden tulee pidättäytyä hampaiden harjauksesta, hampaiden pesusta, syömisestä, juomisesta tai tupakoinnista 6 tuntia ennen näytteenottoa. Kun potilasta on istunut 10 minuuttia (freasin aiheuttaman isopreenipitoisuuden nousun välttämiseksi (11) ), potilasta pyydetään täyttämään 10 litraa hengitystä tedlar-pussiin (SKC, Etelä-Korea). Samanaikaisesti identtinen tedlar-pussi on täytettävä ympäröivällä ilmalla.

Jokaisen näytteenoton yhteydessä tallennetaan seuraavat tiedot:

Potilaan ominaisuudet, mukaan lukien ikä, hematoonkologinen diagnoosi, aika alkuperäisestä diagnoosista, nykyinen hoito, aika HCT:stä tarvittaessa, taustadiagnoosit Nykyinen lääkehoito, mukaan lukien kaikki edellisen kuukauden aikana määrätyt antibiootit ja sienilääkkeet.

Nykyiset diagnostiset testit, mukaan lukien kaikki viljelmät, serologiset määritykset, nukleiinihappojen monistustutkimukset, täydellinen verenkuva ja kemia, vorikonatsolin plasmapitoisuus ja rintakehän kuvantaminen viimeisen kuukauden aikana.

Näytteen käsittely ja VOC-uutto:

Kaikki tedlar-pussit säilytetään 4 ℃:ssa keräyksen jälkeen. Adsorptio kahteen rinnakkaiseen lämpödesorptioputkeen on suoritettava Gilian LFS-113 Low Flow Personal Air Sampling Pump -näytteenottopumpulla (SRA-laitteet, Milano, Italia), suoritetaan 72 tunnin kuluessa näytteenotosta ja säilytetään ympäristöolosuhteissa. Nämä näytteet merkitään (koodataan) ja muunnetaan Environmental Chemistry Laboratoryksi (Kasali Institute of Chemistry, Hebrew University of Jerusalem, Israel)

Analyysi:

Terminen desorptio suoritetaan 290 °C:ssa 20 minuutin ajan käyttämällä analyyttistä laatua olevaa (99,999 %) heliumkaasua kantajana. Ruiskutus-tandem-kaasukromatografinen massaspektroskopia (GC-MS) on suoritettava samanlaisissa tulolämpötiloissa, jotka eivät ylitä 40 ml/min virtausta. Alkuperäinen GC-lämpötilaohjelma jäljittelee aiemmin raportoituja (10) protokollia: 40 ˚C 3 minuutin ajan, nostetaan 70 ˚C nopeudella 5 ˚C minuutissa ja pidetään 3 minuuttia, nostetaan 203 ˚C 7 ˚C:ssa. minuutissa ja pidettiin 4 minuuttia, nostettiin nopeasti 270 ˚C:seen ja pidettiin 5 minuuttia. Kolminkertainen nelimassaspektrometri (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) on kytkettävä rinnakkain, massamittausalueella 20–400 m/z.

Invasiivisen keuhkoaspergilloosin diagnoosi määritellään päivitettyjen EORTC-kriteerien (4) mukaan jommallakummalla seuraavista:

Vahvistettu IPA määritelty hengityselinten biopsianäytteeksi, jossa on positiivinen Aspergillus spp -viljelmä tai histopatologinen näyttö hyfien aiheuttamasta kudosinvaasiosta.

"Todennäköinen IPA", joka määritellään (1) yhteensopiviksi röntgenkuvauksiksi rintakehän TT:ssä (tiheä, hyvin rajattu leesio(t) halomerkillä, ilmapuolikuulla tai ontelolla tai ilman) ja jokin seuraavista: todiste Aspergilluksesta spp sytologialla, suoralla mikroskopialla tai viljelmällä mistä tahansa hengitysnäytteestä, mukaan lukien yskös, bronko-alveolaarinen huuhteluneste (BAL) tai keuhkoputkiharja. Plasmasta, seerumista tai BAL-nesteestä havaittu positiivinen D-galaktomannaaniantigeeni Positiivinen polymeraasiketjureaktio (PCR) Aspergillukselle spp havaittu plasmasta, seerumista tai BAL-nesteestä "Mahdollinen IPA", joka määritellään (1) yhteensopiviksi röntgenpiirteiksi rintakehän TT:ssä (tiheä, hyvin rajattu leesio/leesio(t) halomerkillä, ilma-puolikuun merkillä tai ontelolla tai ilman niitä ) ilman varmentavia laboratoriolöydöksiä.

Lisätietoa IPA-diagnoosin todennäköisyydestä kerää kaksi riippumatonta tarkkailijaa (I.G. ja A.S.), jotka tarkastelevat täydellistä sähköistä sairauskertomusta (EMR) tutkimusjakson lopussa ja antavat yhden todennäköisyyspisteen 1-10 (1 on erittäin pieni). IPA:n todennäköisyys, 10 vastaa lähes varmaa IPA:ta) ottaen huomioon taudin koko kliinisen kulun.

Lisämuuttujat ja tietolähteet: Kaikille kohorttipotilaille epidemiologiset ja kliiniset tiedot poimitaan sairaalassamme käytetystä sähköisestä sairauskertomusjärjestelmästä (EMR) MD-clone-ohjelmiston avulla. Meidän on hankittava potilaiden henkilötiedot, jotta voimme päästä käsiksi heidän päivittäisessä seurannassaan kirjattuihin tietoihinsa heidän sairauskarttaan, koska joitain tietoja ei ole koodattu. Kaikki tiedot on myöhemmin koodattava ja niistä on poistettava kaikki henkilötunnukset, mukaan lukien etu-, sukunimi, syntymäaika, henkilötunnus ja osoite. Kaikki tiedot on tallennettava nimetylle kiintolevylle ensisijaisen tutkijan käsissä. Tietolähteinä ovat potilaan tiedosto "prometheus" EMR-rekisterissä sekä MD-klooniohjelmiston avulla haetut tiedot. Kerätyt tiedot sisältävät: demografiset tiedot (ikä, sukupuoli), taustadiagnoosit, oleskelun kesto ja siirto muihin yksiköihin, laboratoriotulokset, kirjatut elintoiminnot ja käytetty hapetusmenetelmä päivittäisessä seurannassa dokumentoidusti.

Näytteenottoaikataulu: Ensimmäinen näyte tähän tutkimukseen sisältyvistä suostuvista potilaista otetaan 7 päivän sisällä rintakehän TT:n lähtötilanteesta. Myöhemmin, jos hoitava lääkäri epäilee kliinistä IPA:ta – epäily, joka aina johtaa rintakehän TT:n suorittamiseen, näytteet kerätään 7 päivän kuluessa rintakehän TT:stä. Lisänäytteet otetaan 7 päivän kuluessa siitä, kun hoitava lääkäri on lopettanut sienilääkehoidon. Näytteenottoaikataulu on esitetty kuvassa 1.

Kuva 1 - Näytteenottostrategia. Tämän tutkimuksen interventio rajoittuu lihavoitulla punaisella alleviivattuun näytteenottoon – kaikki muut vaiheet ovat osa AML-potilaiden tavanomaista hoitoa, eivätkä osallistuminen tähän tutkimukseen vaikuta millään tavalla. AML - akuutti myelooinen leukemia; Dx - Diagnoosi; CT - tietokonetomografia; IPA - invasiivinen keuhkojen aspergilloosi; Tx - Hoito; d/c - lopetettu; GGO - Hiottu lasin läpikuultamattomuus.

Tiedonkäsittely ja tilastollinen analyysi:

Kliiniset tiedot on analysoitava käyttämällä tarvittaessa kuvaavia tilastoja, parametrisia ja ei-parametrisia testejä. Kaikki tilastollinen analyysi on suoritettava käyttämällä R-ohjelmiston versiota 4.0.0 ("Arbor day") tai uudempaa. Ensisijaisen tutkijan on tallennettava kaikki tunnistettavissa olevat tiedot, mukaan lukien potilaan lähtötilanteen ominaisuudet, laboratorio- ja kuvantamistulokset sekä aiemmat diagnoosit ja hoitotiedot, nimetylle RAS-salatulle puolifaasimuistilaitteelle tutkimuksen ajan. Potilaan nimiä, henkilötunnusta, osoitetta ja syntymäaikaa ei tallenneta.

Massaspektroskopian tulokset tarkistetaan MassHunter-työasemalla ja -ohjelmistolla (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Osittainen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi suoritetaan käyttämällä SIMCA-ohjelmiston versiota 14.0 tai uudempaa (MKS Umetrics, Ruotsi). Kullekin m/z-alueelle rakennetaan logistinen regressiomalli, jonka avulla voidaan laskea muuttujan merkitys projektiolle (VIP). Kaikille VIP:ille ≥1 vastaava ioniprofiili valitaan mahdolliseksi kohteeksi. Näitä verrataan aiempiin IPA:ta osoittaviin metaboliitteihin (10,11) sekä olemassa olevaan tietokantaamme, josta on yhteenveto LIITTEESSÄ A. Tällainen tunnistaminen on ratkaisevan tärkeää, koska sama m/z-arvo voi vastata eri metaboliitteja eri aineina. voi olla sama ituplasman varaussuhde. Seuraavaksi kaikki tunnistetut aineet vahvistetaan National Institute of Standards and Technologyn (NIST) 11 Mass Spectral Libraryn (Scientific Instrument Services, Ringoes, New Jersey) ja puhtaan kemiallisen standardin mukaan. Lopuksi digitaalinen matriisi, joka koostuu valituista ominaispiirteistä VOC-yhdisteistä, tuodaan pythoniin (versio 3.10.5 tai uudempi) erilaisten luokitusmallien luomiseksi, ja ennustavat suorituskyvyt arvioidaan binäärilogistisella regressiolla. Korrelaatiot uloshengitetyn hengityksen VOC-ilmentymistasojen sekä seerumin ja BAL-d-galaktomannaani- ja IPA-diagnostisen varmuuden (vahvistettu, todennäköinen tai mahdollinen, kuten alla on määritelty) välillä saadaan aikaan käyttämällä Henkilön r.

Näytteen koko ja teho:

Tähän prospektiiviseen pitkittäiseen tutkimukseen potilaat, joilla on suuri todennäköisyys kehittää IPA (eli potilaat, joilla on diagnosoitu akuutti leukemia), otetaan mukaan diagnoosin yhteydessä. Koska keskuksemme suorittaa lähtötilanteen rintakehän CT-seulonnan mahdollisen IPA:n tunnistamiseksi lähtötilanteessa, normaalin röntgenkuvan jälkeen kerätyt VOC-yhdisteet voivat toimia monina kontrollina. Vähintään 15 % tällaisista potilaista kehittää IPA:ta seuraavien kuukausien aikana(3), mikä rajoittaa rekrytoinnin yhteydessä tarvittavaa otoskokoa. Aiemmin raportoitujen seurantatoimien noudattamisen perusteella (12) odotamme keskeyttämisasteen olevan alhainen, mikä mahdollistaa aiemmin vaikeasti havaittavien hoidon jälkeisten muutosten havaitsemisen VOC-profiileissa.

Näitä laskelmia varten oletimme, että aiemmin raportoitu VOC-määrityksen herkkyys (verrattuna mikrobiologiaan tai antigeenitestaukseen hengitystieeritteissä, BAL:ssa tai potilaan seerumissa) on 80-95 %.(10) Viimeaikaiset retrospektiiviset tutkimukset ovat osoittaneet, että IPA:n ilmaantuvuus on 5 % ensimmäisessä TT-seulonnassa ja lisäksi 10 % ensimmäisen sairaalahoidon aikana.(3) Tämä tarkoittaa 124 potilaan arvioitua otoskokoa, joka lasketaan hyväksytyn merkitsevyyden (alfa = 0,05) ja tehon (beta = 0,8) perusteella. Kun otetaan huomioon arviolta 70 %:n ilmoittautuminen ja ylimääräinen 15 %:n poissulkemisaste, arvioitu kokonaisotoskoko on 208 potilasta. Sairaalassamme hoidetun 90 uuden akuutin leukemiatapauksen vuotuisen keskimääräisen ilmaantuvuuden arvioiden tämä näytteenottotavoite pitäisi saavuttaa helposti ennalta määritellyn 30 kuukauden rekrytointijakson aikana. Odotamme siis osallistujamäärän olevan 300.

EETTISET NÄKÖKOHDAT IPA-tunnistuksen noninvasiivisten tekniikoiden kehittäminen ja parantaminen on ollut useiden ammattiyhdistysten tavoite yli kahden vuosikymmenen ajan. (1,4) Potilaiden ehdottama diagnostinen työkalu aiheuttaa mahdollisimman vähän tai ei ollenkaan haittaa osallistujille, ja pidämme mahdollisia sivuvaikutuksia ja vaaroja merkityksettöminä tässä täysin ei-invasiivisessa menetelmässä.

Tietojen poimimisen jälkeen kaikista tiedoista on poistettava kaikki tunnistetiedot, mukaan lukien nimi, sukunimi, henkilötunnus, tapausnumero, syntymäaika ja osoite - kaikki tuhotaan, kun alkuperäinen tietojen poimiminen on valmis. Tiedot on tallennettava turvallisesti RAS-salatulle, nimetylle SD-laitteelle, joka on PI:n käsissä, minimoiden todennäköisyys, että tämä tutkimus vaikuttaa tietojen yksityisyyteen tai potilaiden lääketieteelliseen luottamuksellisuuteen. Ottaen huomioon tämän tutkimuksen tulosten välittömän vaikutuksen vakavasti sairaiden hoitoon ja ennusteeseen, tämän tutkimuksen hyödyt ylittävät mahdolliset riskit.

Rahoitus Tutkimukseen ei toistaiseksi ole myönnetty ulkopuolista rahoitusta.

Bibliografia

1. Blot SI, Taccone FS, Van den Abeele A-M, Bulpa P, Meersseman W, Brusselaers N, et ai. Kliininen algoritmi invasiivisen keuhkojen aspergilloosin diagnosoimiseksi kriittisesti sairailla potilailla. Am J Respir Crit Care Med. 2012 heinäkuu 1;186(1):56-64.
2. Souza L, Nouér SA, Morales H, Simões B, Solza C, Queiroz-Telles F, et ai. Invasiivisten sienitautien epidemiologia hematologisilla potilailla. Mykoosit. 2021 maaliskuu;64(3):252-6.
3. Bitterman R, Hardak E, Raines M, Stern A, Zuckerman T, Ofran Y et ai. Lähtötilanteen rintakehän tietokonetomografia invasiivisen keuhkoaspergilloosin varhaiseen diagnosointiin hematoonkologisilla potilailla: Prospektiivinen kohorttitutkimus. Clin Infect Dis. 2019, 30. lokakuuta; 69(10):1805-8.
4. Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, Steinbach WJ, Baddley JW, Verweij PE, et ai. Euroopan syövän tutkimus- ja hoitojärjestön ja mykoosien opintoryhmän koulutus- ja tutkimuskonsortion invasiivisen sienitautien konsensusmääritelmien tarkistus ja päivitys. Clin Infect Dis. 2020 Sep 12;71(6):1367-76.
5. Savelieff MG, Pappalardo L. Uudet huippuluokan metaboliittipohjaiset diagnostiset työkalut aspergilloosiin. PLoS Patog. 2017 7. syyskuuta 13(9):e1006486.
6. Tsou P-H, Lin Z-L, Pan Y-C, Yang H-C, Chang C-J, Liang S-K, et ai. Hengityksen haihtuvien orgaanisten yhdisteiden tutkiminen keuhkosyövän tarkkaa ennustamista varten. Syövät (Basel). 2021 21. maaliskuuta 13(6).
7. Kamal F, Kumar S, Edwards MR, Veselkov K, Belluomo I, Kebadze T, et ai. Viruksen aiheuttamat haihtuvat orgaaniset yhdisteet ovat havaittavissa uloshengitetystä hengityksestä keuhkoinfektion aikana. Am J Respir Crit Care Med. 2021 1.11.204(9):1075-85.
8. Castro-Rodriguez JA, Cifuentes L, Martinez FD. Astman ennustaminen kliinisten indeksien avulla. Edessä Pediatr. 2019 31. heinäkuuta; 7:320.
9. Das S, Pal M. Tarkastelu-ei-invasiivinen ihmisen terveyden seuranta uloshengityshengitysanalyysin avulla: Kattava katsaus. J Electrochem Soc. 2020 3. helmikuuta 167(3):037562.
10. Koo S, Thomas HR, Daniels SD, Lynch RC, Fortier SM, Shea MM, et ai. Hengityssienen sekundaarinen metaboliitti invasiivisen aspergilloosin diagnosoimiseksi. Clin Infect Dis. 2014 15.12.;59(12):1733-40.
11. Li Z-T, Zeng P-Y, Chen Z-M, Guan W-J, Wang T, Lin Y, et ai. Uloshengitetyt haihtuvat orgaaniset yhdisteet kroonista keuhkoaspergilloosia sairastavien potilaiden tunnistamiseen. Front Med (Lausanne). 23. syyskuuta 2021; 8:720119.
12. Hardak E, Fuchs E, Leskes H, Geffen Y, Zuckerman T, Oren I. Polymeraasiketjureaktion diagnostinen rooli bronkoalveolaarisessa huuhtelunesteessä invasiiviseen keuhkoaspergilloosiin immuunipuutteisilla potilailla - Retrospektiivinen kohorttitutkimus. Int J Infect Dis. 2019 kesäkuu;83:20-5.