膠芽腫における薬物スクリーニングのための患者由来オルガノイド (GlioPDO)

腫瘍の外科的生検から採取した患者由来オルガノイド (PDO) は、特定の治療戦略に対する個々の患者の反応をテストする革新的なツールです。 オルガノイドは、培養下で維持および増殖できる器官特異的かつ自己組織化細胞で構成される三次元 (3D) 構造です。 現在までに、前立腺がん、卵巣がん、乳がんなどの非常に多くの種類のがんから PDO が確立されています。 神経膠芽腫 PDO も生成されており、それらは、変異レベルでも、遺伝子発現プロファイルや細胞の不均一性の観点でも、親腫瘍の特徴を維持していることが示されています。 これらは GBM 細胞株よりも元の腫瘍の特徴をよく再現しているため、個別化医療アプローチにとって重要な進歩となります。 したがって、神経膠芽腫 PDO は、薬物スクリーニング、CAR-T 細胞検査、およびモデルモデルにおける脳の同所性異種移植片の生成に有用な前臨床モデルを表します。 この観点から、PDO は神経膠芽腫患者の分子の不均一性をより詳細に特徴付け、親腫瘍の遺伝的特性を模倣した状況で新しい治療戦略をテストする機会を提供します。

免疫療法は、一部の種類のがんに対する強力な抗がんアプローチとして登場しつつあります。 免疫療法は、非自己抗原を認識する免疫系の能力を利用して、がん細胞を標的にして破壊します。 免疫チェックポイント阻害剤（例： 抗 PD-1 および抗 CTLA-4 モノクローナル抗体）は、黒色腫などの高い突然変異負荷を示す腫瘍に有効であることが示されました。 残念なことに、神経膠芽腫は突然変異負荷が低いため、少量のネオアンチゲンが生成されます。 さらに、神経膠芽腫は非常に不均一であるため、すべての患者が同じ抗原を産生するわけではありません。 したがって、複数のネオアンチゲンを標的とする免疫療法を開発し、ネオアンチゲン認識戦略と免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせることにより、より高い利益が達成される可能性があります。 この観点から、DNA脱メチル化剤による神経膠芽腫における通常サイレントな転移因子（TE）の転写を活性化するエピジェネティックな制御は、ネオアンチゲンの産生を増強し、特異的な免疫応答を引き起こす可能性がある。

TE の転写は、ほとんどの成体細胞では低いか存在しませんが、胚発生中、幹細胞、そして興味深いことに腫瘍ではより活発になります。 腫瘍における TE の抑制解除は、DNA 脱メチル化やヒストン脱アセチル化など、TE 遺伝子座に対する複数のエピジェネティックな変化によって起こります。 どちらのエピジェネティックな変化も発癌に関連する可能性があり、その結果、さまざまなレベルのエピジェネティックな調節解除が引き起こされます。 健康な組織と比較して腫瘍における TE の過剰発現により、がんにおける抗 TE T 細胞応答の探索が促進されました。 プロテオゲノムアプローチにより、腫瘍細胞上のヒト白血球抗原 (HLA)-I 分子によって提示されるペプチドをコードする腫瘍特異的な非標準オープン リーディング フレーム (ORF) が同定されました。 同定されたペプチドのほとんどは、非コードゲノム領域に由来しています。 興味深いことに、これらの潜在的な腫瘍特異抗原のいくつかは複数の患者で見つかり、インビトロまたはマウスモデルで免疫応答を誘導する可能性があります。 我々は最近、いくつかの転移因子を含む、SOD1 遺伝子座 (SOD1-DT) のアンチセンス方向の長い非コード RNA (lncRNA) の特性を明らかにしました。 これらの一部 (LTR および Alu) には ORF が含まれており、異なるエピトープをコードしている可能性があります。 これらの要素のインシリコ翻訳により、癌免疫療法の GBM 特異的標的としてすでに試験されたエピトープに対応するペプチドを同定しました。 しかし、これらの転移因子の DNA 配列は、神経組織および U87 GBM 細胞株では高度にメチル化されています (Genome Browser からのデータ)。 我々は、LTR12C ファミリーに属する TE の研究に焦点を当てます。なぜなら、LTR12C ファミリーはエンハンサー様およびプロモーター様の要素として機能し、組織特異的な方法でトランスクリプトミクスのランドスケープを形成することが示されているからです。 DNMTi および HDACi による処理は標準遺伝子の発現を変化させないが、LTR の新規転写を誘導し、それによって特定の遺伝子の発現が促進されることがすでに実証されています。 したがって、エピトープの生成に加えて、特定のLTRを活性化することによって、それらに接続されている遺伝子を活性化することが可能です。 特に、LTR12C は、TP63 や TNFRSF10B などのアポトーシス促進遺伝子の制御因子として同定されました。 したがって、提案された戦略は、制御された方法でアポトーシス促進遺伝子および免疫原性エピトープを生成し、非常に特異的な結果を保証するための一般的に適用可能な手段を表す可能性がある。

ネオエピトープのもう 1 つの潜在的な原因は、スプライシングの欠陥です。 スプライシングは、スプライセオソームと呼ばれる大きな高分子機構によって操作されるプレメッセンジャー RNA (mRNA) 成熟の基本的なステップです。 スプライセオソームはイントロンを除去し、プレ mRNA の隣接するエクソンを連結して、成熟 mRNA を生成します。 多くのエクソンの制御された選択的スプライシング (AS) は、単一遺伝子から複数のタンパク質アイソフォームを生成するために細胞によって利用されます。 しかし、癌細胞ではスプライシングプログラムの変化が調節されていないことが多く、脳腫瘍を含む腫瘍に対して対処可能な脆弱性を生み出します。 原発性および再発性 GBM と非悪性脳組織データセットのプロファイリングにより、GBM 間で異なるように制御され、ネオエピトープに翻訳される可能性のある AS イベントが特定されました。 これらの結果は、スプライシング調節が膠芽腫の有効な治療戦略となる可能性があることを示唆しています。 実際、GBM 細胞におけるアルギニン メチル トランスフェラーゼ PRMT5 の阻害はスプライシングを調節不全にし、in vitro と in vivo の両方でイントロン保持の増加と細胞老化を引き起こします。 さらに、PRMT5 は腫瘍の自己再生に必要な GSC の保存にも役割を果たします。 最近、スプライシングの薬理学的阻害によりスプライシング由来の免疫原性ネオエピトープが生成され、これが腫瘍細胞上のMHC-Iによって提示され、インビボでT細胞免疫応答を誘導することが示された。 もう 1 つの潜在的な治療標的は、GBM で過剰発現されるスプライシング機構の中心成分であるスプライシング因子 3b サブユニット 1 (SF3B1) です。 総合すると、これらの結果は、神経膠芽腫の PDO および GSC における DNA 脱メチル化剤およびスプライシング阻害剤の効果を研究し、この疾患の新しい治療戦略を開発するための適切な候補を特定する理論的根拠を裏付けます。

上述のアプローチは、膠芽腫の神経手術を受ける予定の登録患者に適用される。 神経球培養物および PDO は原発腫瘍組織から確立されます。 TE 発現を誘導し、スプライシングを調節するための薬物スクリーニングと細胞操作が適用されます。 インビトロ試験の結果は、腫瘍の分子プロファイル、治療に対する反応、および全体的な患者の転帰と相関します。