Органоиды, полученные от пациента, для скрининга лекарств при глиобластоме (GlioPDO)

Органоиды, полученные из пациента (PDO), полученные из хирургических биопсий опухолей, являются инновационным инструментом для проверки реакции отдельных пациентов на конкретные терапевтические стратегии. Органоиды — это трехмерные (3D) структуры, состоящие из органоспецифичных и самоорганизующихся клеток, которые можно поддерживать и размножать в культуре. На сегодняшний день PDO установлены для большого числа типов рака, включая рак простаты, яичников и молочной железы. Также были получены PDO глиобластомы, и было показано, что они сохраняют характеристики своих родительских опухолей как на мутационном уровне, так и с точки зрения профилей экспрессии генов и клеточной гетерогенности. Поскольку они воспроизводят характеристики исходной опухоли лучше, чем клеточные линии GBM, они представляют собой важное достижение для подходов персонализированной медицины. Таким образом, PDO глиобластомы представляют собой полезные доклинические модели для скрининга лекарств, тестирования CAR-T-клеток и для создания ортотопических ксенотрансплантатов головного мозга в модельных моделях. С этой точки зрения PDO дают возможность лучше охарактеризовать молекулярную гетерогенность пациентов с глиобластомой и протестировать новые терапевтические стратегии в контексте, имитирующем генетические свойства исходной опухоли.

Иммунотерапия становится мощным противораковым подходом при некоторых типах рака. Иммунотерапия использует способность иммунной системы распознавать несамоантигены для нацеливания и уничтожения раковых клеток. Ингибиторы иммунных контрольных точек (например, моноклональные антитела анти-PD-1 и анти-CTLA-4) оказались эффективными при опухолях с высокой мутационной нагрузкой, таких как меланома. К сожалению, глиобластома имеет низкую мутационную нагрузку, что приводит к небольшому количеству неоантигенов. Более того, глиобластома очень гетерогенна, а это означает, что не все пациенты производят одни и те же антигены. Таким образом, более высокие преимущества могут быть достигнуты за счет разработки иммунотерапии, нацеленной на несколько неоантигенов, и за счет комбинирования стратегий распознавания неоантигенов с ингибиторами блокады иммунных контрольных точек. С этой точки зрения, эпигенетическая регуляция, направленная на активацию транскрипции обычно молчащих мобильных элементов (TE) при глиобластоме с помощью агентов, деметилирующих ДНК, может усиливать выработку неоантигенов и запускать специфический иммунный ответ.

Транскрипция TE низкая или отсутствует в большинстве взрослых клеток, тогда как она более активна во время эмбрионального развития, в стволовых клетках и, что интересно, в опухолях. Дерепрессия TE в опухолях происходит за счет множественных эпигенетических изменений локусов TE, включая деметилирование ДНК и деацетилирование гистонов. Оба эпигенетических изменения могут быть связаны с онкогенезом, что приводит к разным уровням эпигенетической дерегуляции. Сверхэкспрессия TE в опухолях по сравнению со здоровой тканью побудила к поиску ответов Т-клеток против TE при раке. Протеогеномные подходы выявили опухолеспецифичные неканонические открытые рамки считывания (ORF), которые кодируют пептиды, представленные молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)-I на опухолевых клетках. Большинство идентифицированных пептидов происходят из некодирующих участков генома. Интересно, что некоторые из этих потенциальных опухолеспецифичных антигенов обнаруживаются у многих пациентов и могут вызывать иммунные реакции in vitro или на мышиных моделях. Недавно мы охарактеризовали длинную некодирующую РНК (днРНК) в антисмысловом направлении локуса гена SOD1 (SOD1-DT), которая включает несколько мобильных элементов. Некоторые из них (LTR и Alu) содержат ORF и потенциально могут кодировать разные эпитопы. С помощью трансляции этих элементов in silico мы идентифицировали пептиды, соответствующие эпитопам, уже протестированным в качестве специфичных для GBM мишеней для иммунотерапии рака. Однако последовательность ДНК этих мобильных элементов сильно метилирована в нервной ткани и в клеточной линии U87 GBM (данные Genome Browser). Мы сосредоточимся на изучении TE, принадлежащих к семейству LTR12C, поскольку было показано, что они действуют как энхансероподобные и промотороподобные элементы, формируя ландшафт транскриптомики тканеспецифичным образом. Уже было продемонстрировано, что обработка DNMTi и HDACi не изменяет экспрессию канонических генов, но индуцирует транскрипцию de novo LTR, что, в свою очередь, управляет экспрессией специфических генов. Таким образом, помимо производства эпитопа путем активации специфических LTR можно активировать связанные с ними гены. Примечательно, что LTR12C был идентифицирован как регулятор проапоптотических генов, таких как TP63 и TNFRSF10B. Таким образом, предложенная стратегия может представлять собой общеприменимый способ контролируемого производства проапоптотических генов и иммуногенных эпитопов, гарантируя очень специфический результат.

Другим потенциальным источником неоэпитопов является дефектный сплайсинг. Сплайсинг — это фундаментальный этап созревания пре-мессенджерной РНК (мРНК), управляемый крупным макромолекулярным механизмом, называемым сплайсосомой. Сплайсосома удаляет интроны и лигирует фланкирующие экзоны пре-мРНК, образуя зрелые мРНК. Регулируемый альтернативный сплайсинг (АС) многих экзонов используется клетками для генерации множества изоформ белка из одного гена. Однако измененная программа сплайсинга часто дерегулируется в раковых клетках, создавая опасную уязвимость для опухолей, включая опухоли головного мозга. Профилирование наборов данных первичных и рецидивирующих ГБМ и доброкачественных тканей головного мозга выявило события АС, которые по-разному регулируются при ГБМ и которые могут быть транслированы в неоэпитопы. Эти результаты позволяют предположить, что модуляция сплайсинга может представлять собой действительную терапевтическую стратегию при глиобластоме. Действительно, ингибирование аргининметилтрансферазы PRMT5 в клетках GBM нарушает регуляцию сплайсинга и приводит к увеличению задержки интронов и старению клеток как in vitro, так и in vivo. Более того, PRMT5 играет роль в сохранении GSC, которые необходимы для самообновления опухоли. Недавно было показано, что фармакологическое ингибирование сплайсинга приводит к образованию полученных в результате сплайсинга иммуногенных неоэпитопов, которые презентируются MHC-I на опухолевых клетках и индуцируют Т-клеточный иммунный ответ in vivo. Другой потенциальной терапевтической мишенью является субъединица 1 фактора сплайсинга 3b (SF3B1), основной компонент механизма сплайсинга, который сверхэкспрессируется в GBM. В совокупности эти результаты подтверждают обоснованность изучения эффектов агентов, деметилирующих ДНК, и ингибиторов сплайсинга в PDO и GSC глиобластомы с целью выявления подходящих кандидатов для разработки новых терапевтических стратегий для этого заболевания.

Описанные выше подходы будут применяться к проспективно включенным пациентам, перенесшим нейрохирургическое вмешательство по поводу глиобластомы. Культуры нейросфер и PDO будут созданы из первичной опухолевой ткани. Будут применяться скрининг лекарств и манипуляции с клетками для индукции экспрессии ТЕ и модуляции сплайсинга. Результаты тестов in vitro будут коррелировать с молекулярным профилем опухоли, реакцией на лечение и общим исходом пациентов.