Patientens afledte organoider til lægemiddelscreening ved glioblastom (GlioPDO)

Patient's Derived Organoids (PDO'er) fra tumorkirurgiske biopsier er et innovativt værktøj til at teste individuelle patienters respons på specifikke terapeutiske strategier. Organoider er tredimensionelle (3D) strukturer lavet af organspecifikke og selvorganiserende celler, som kan opretholdes og formeres i kultur. Til dato er PDO'er blevet etableret fra et stort antal kræfttyper, herunder prostata-, ovarie- og brystkræft. Glioblastom PDO'er er også blevet produceret, og de viste sig at opretholde egenskaberne af deres forældretumorer, både på mutationsniveau og med hensyn til genekspressionsprofiler og cellulær heterogenitet. Da de rekapitulerer karakteristikaene af den oprindelige tumor bedre end GBM-cellelinjer, repræsenterer de et vigtigt fremskridt for personaliserede medicinske tilgange. Således repræsenterer glioblastom PDO'er nyttige prækliniske modeller til lægemiddelscreening, CAR-T-celletestning og til generering af hjerneorthotopiske xenografter i modelmodeller. I dette perspektiv tilbyder PDO'erne en mulighed for bedre at karakterisere den molekylære heterogenitet af glioblastompatienter og at teste nye terapeutiske strategier i en kontekst, der efterligner forældres tumorgenetiske egenskaber.

Immunterapi er ved at dukke op som en kraftfuld anticancer-tilgang i nogle kræfttyper. Immunterapi udnytter immunsystemets evne til at genkende ikke-selv-antigener til at målrette og ødelægge kræftceller. Immune checkpoint-hæmmere (f. anti-PD-1 og anti-CTLA-4 monoklonale antistoffer) blev vist effektive i tumorer, der udviser en høj mutationsbyrde, såsom melanom. Desværre har glioblastom en lav mutationsbyrde, hvilket resulterer i en lille mængde neoantigener. Desuden er glioblastom meget heterogent, hvilket betyder, at ikke alle patienter producerer de samme antigener. Således kunne højere fordele opnås ved at udvikle immunterapier, der retter sig mod flere neoantigener og ved at kombinere neoantigengenkendelsesstrategier med immunkontrolpunktblokadehæmmere. I dette perspektiv kan epigenetisk regulering for at aktivere transkriptionen af ​​normalt tavse transposerbare elementer (TE'er) i glioblastom ved hjælp af DNA-demethyleringsmidler øge produktionen af ​​neoantigener og udløse et specifikt immunrespons.

Transskription af TE'er er lav eller fraværende i de fleste voksne celler, mens den er mere aktiv under embryonal udvikling, i stamceller og, spændende nok, i tumorer. TEs de-repression i tumorer opstår gennem flere epigenetiske ændringer af TE loci, herunder DNA-demethylering og histon-deacetylering. Begge epigenetiske ændringer kan være forbundet med onkogenese, hvilket resulterer i forskellige niveauer af epigenetisk deregulering. TEs overekspression i tumorer sammenlignet med sundt væv har foranlediget søgningen efter anti-TE T-celleresponser i cancer. Proteogenomiske tilgange har identificeret tumorspecifikke, ikke-kanoniske åbne læserammer (ORF'er), der koder for peptider præsenteret af humant leukocytantigen (HLA)-I-molekyler på tumorceller. De fleste af de identificerede peptider stammer fra ikke-kodende genomiske regioner. Interessant nok findes nogle af disse potentielle tumorspecifikke antigener i flere patienter og kan inducere immunresponser in vitro eller i musemodeller. Vi har for nylig karakteriseret et langt ikke-kodende RNA (lncRNA) i antisense-retningen af ​​SOD1-gen-locus (SOD1-DT), som inkluderer flere transposerbare elementer. Nogle af disse (LTR og Alu) indeholder ORF'er og kunne potentielt kode for forskellige epitoper. Ved silico-translation af disse elementer identificerede vi peptider svarende til epitoper, der allerede er testet som GBM-specifikke mål for cancerimmunterapier. Imidlertid er DNA-sekvensen af ​​disse transponerbare elementer stærkt methyleret i nervevævet og i U87 GBM-cellelinjen (data fra Genome Browser). Vi vil fokusere på undersøgelsen af ​​de TE'er, der tilhører LTR12C-familien, fordi de har vist sig at fungere som enhancer-lignende og promotor-lignende elementer, der former transkriptomiske landskaber på en vævsspecifik måde. Det er allerede blevet påvist, at behandlinger med DNMTi og HDACi ikke ændrer ekspressionen af ​​kanoniske gener, men inducerer de novo transkription af LTR'er, som igen driver ekspressionen af ​​specifikke gener. Udover at producere epitopen, ved at aktivere specifikke LTR'er, er det derfor muligt at aktivere de gener, der er forbundet med dem. LTR12C blev især identificeret som regulator af proapoptotiske gener, såsom TP63 og TNFRSF10B. Den foreslåede strategi kunne således repræsentere et generelt anvendeligt middel til at producere proapoptotiske gener og immunogene epitoper på en kontrolleret måde, hvilket sikrer et meget specifikt resultat.

En anden potentiel kilde til neoepitoper er defekt splejsning. Splejsning er et grundlæggende trin i præ-messenger RNA (mRNA) modning drevet af et stort makromolekylært maskineri kaldet spliceosomet. Spliceosomet fjerner intronerne og ligerer de flankerende exoner af præ-mRNA'erne, hvilket giver de modne mRNA'er. Reguleret alternativ splejsning (AS) af mange exoner udnyttes af celler til at generere flere proteinisoformer fra et enkelt gen. Imidlertid er det ændrede splejsningsprogram ofte dereguleret i kræftceller, hvilket genererer en handlingsvenlig sårbarhed for tumorer, herunder hjernetumorer. Profilering af primære og tilbagevendende GBM- og ikke-maligne hjernevævsdatasæt har identificeret AS-hændelser, der er forskelligt reguleret i GBM, og som kunne oversættes til neoepitoper. Disse resultater tyder på, at splejsningsmodulation kunne repræsentere en gyldig terapeutisk strategi for glioblastom. Faktisk dysregulerer hæmning af argininmethyltransferase PRMT5 i GBM-celler splejsning og fører til øget intronretention og celleældning både in vitro og in vivo. Desuden har PRMT5 en rolle i bevarelsen af ​​GSC'er, som er nødvendige for tumor selvfornyelse. For nylig blev det vist, at farmakologisk inhibering af splejsning genererer splejsningsafledte immunogene neoepitoper, som præsenteres af MHC-I på tumorceller og inducerer en T-celle-immunrespons in vivo. Et andet potentielt terapeutisk mål er splejsningsfaktor 3b underenhed 1 (SF3B1), en kernekomponent i splejsningsmaskineriet, der er overudtrykt i GBM. Tilsammen understøtter disse resultater begrundelsen for at studere virkningerne af DNA-demethyleringsmidler og splejsningshæmmere i glioblastom PDO'er og GSC'er for at identificere egnede kandidater til at udvikle nye terapeutiske strategier for denne sygdom.

De ovenfor beskrevne tilgange vil blive anvendt på prospektivt indrullerede patienter, der gennemgår neurokirurgi for glioblastom. Neurosfærekulturer og PDO vil blive etableret fra primært tumorvæv. Lægemiddelscreening og cellemanipulation for at inducere TE-ekspression og for at modulere splejsning vil blive anvendt. Resultaterne af in vitro tests vil blive korreleret med tumor molekylær profil, respons på behandlinger og det samlede patientresultat.