Organoidy pochodzące od pacjentów do badań przesiewowych leków w glejaku wielopostaciowym (GlioPDO)

Organoidy pochodzące od pacjenta (PDO) z biopsji chirurgicznych nowotworów to innowacyjne narzędzie do badania reakcji poszczególnych pacjentów na określone strategie terapeutyczne. Organoidy to trójwymiarowe (3D) struktury wykonane ze specyficznych dla narządu i samoorganizujących się komórek, które można utrzymywać i rozmnażać w hodowli. Do chwili obecnej ustalono PDO dla wielu typów nowotworów, w tym raka prostaty, jajnika i piersi. Wyprodukowano także PDO glejaka wielopostaciowego i wykazano, że zachowują one cechy charakterystyczne swoich nowotworów macierzystych, zarówno na poziomie mutacji, jak i pod względem profili ekspresji genów i heterogeniczności komórkowej. Ponieważ lepiej odzwierciedlają one charakterystykę pierwotnego nowotworu niż linie komórkowe GBM, stanowią ważny postęp w podejściu do medycyny personalizowanej. Zatem PDO glejaka wielopostaciowego stanowią przydatne modele przedkliniczne do badań przesiewowych leków, testowania komórek CAR-T i wytwarzania ortotopowych ksenoprzeszczepów mózgu w modelach modelowych. Z tej perspektywy PDO dają możliwość lepszego scharakteryzowania heterogeniczności molekularnej pacjentów z glejakiem wielopostaciowym i przetestowania nowych strategii terapeutycznych w kontekście naśladującym właściwości genetyczne nowotworu macierzystego.

Immunoterapia staje się skuteczną metodą przeciwnowotworową w przypadku niektórych typów nowotworów. Immunoterapia wykorzystuje zdolność układu odpornościowego do rozpoznawania antygenów obcych w celu namierzania i niszczenia komórek nowotworowych. Inhibitory punktów kontrolnych układu odpornościowego (np. przeciwciała monoklonalne anty-PD-1 i anty-CTLA-4) okazały się skuteczne w przypadku nowotworów wykazujących duże obciążenie mutacyjne, takich jak czerniak. Niestety glejak wielopostaciowy charakteryzuje się niskim obciążeniem mutacyjnym, co skutkuje niewielką ilością neoantygenów. Co więcej, glejak wielopostaciowy jest wysoce niejednorodny, co oznacza, że ​​nie wszyscy pacjenci wytwarzają te same antygeny. Zatem większe korzyści można osiągnąć poprzez opracowanie immunoterapii ukierunkowanych na wiele neoantygenów i połączenie strategii rozpoznawania neoantygenów z inhibitorami blokady punktów kontrolnych układu odpornościowego. Z tej perspektywy regulacja epigenetyczna aktywująca transkrypcję normalnie cichych elementów transpozycyjnych (TE) w glejaku wielopostaciowym przez czynniki demetylujące DNA może zwiększyć produkcję neoantygenów i wywołać specyficzną odpowiedź immunologiczną.

Transkrypcja TE jest niska lub nie występuje w większości dorosłych komórek, podczas gdy jest bardziej aktywna podczas rozwoju embrionalnego, w komórkach macierzystych i, co intrygujące, w nowotworach. Derepresja TE w nowotworach zachodzi poprzez liczne zmiany epigenetyczne w loci TE, w tym demetylację DNA i deacetylację histonów. Obie zmiany epigenetyczne można powiązać z onkogenezą, powodując różne poziomy deregulacji epigenetycznej. Nadekspresja TE w nowotworach w porównaniu ze zdrową tkanką skłoniła do poszukiwania odpowiedzi komórek T anty-TE w przypadku raka. Podejścia proteogenomiczne pozwoliły zidentyfikować specyficzne dla nowotworu, niekanoniczne otwarte ramki odczytu (ORF), które kodują peptydy prezentowane przez cząsteczki ludzkiego antygenu leukocytowego (HLA)-I na komórkach nowotworowych. Większość zidentyfikowanych peptydów pochodzi z niekodujących regionów genomowych. Co ciekawe, niektóre z tych potencjalnych antygenów specyficznych dla nowotworu występują u wielu pacjentów i mogą indukować odpowiedź immunologiczną in vitro lub w modelach mysich. Niedawno scharakteryzowaliśmy długi niekodujący RNA (lncRNA) w kierunku antysensownym locus genu SOD1 (SOD1-DT), który zawiera kilka elementów transpozycyjnych. Niektóre z nich (LTR i Alu) zawierają ORF i mogą potencjalnie kodować różne epitopy. Poprzez translację tych elementów in silico zidentyfikowaliśmy peptydy odpowiadające epitopom już przetestowanym jako cele specyficzne dla GBM w immunoterapiach nowotworowych. Jednakże sekwencja DNA tych elementów transpozycyjnych jest silnie zmetylowana w tkance nerwowej i linii komórkowej U87 GBM (dane z Genome Browser). Skoncentrujemy się na badaniu TE należących do rodziny LTR12C, ponieważ wykazano, że działają one jako elementy podobne do wzmacniaczy i promotorów, kształtując krajobraz transkryptomiki w sposób specyficzny dla tkanki. Wykazano już, że leczenie DNMTi i HDACi nie zmienia ekspresji genów kanonicznych, ale indukuje transkrypcję de novo LTR, które z kolei napędzają ekspresję określonych genów. Oprócz wytwarzania epitopu, poprzez aktywację specyficznych LTR, możliwa jest zatem aktywacja połączonych z nimi genów. Warto zauważyć, że LTR12C zidentyfikowano jako regulator genów proapoptotycznych, takich jak TP63 i TNFRSF10B. Zatem proponowana strategia może stanowić ogólnie stosowany sposób wytwarzania genów proapoptotycznych i epitopów immunogennych w kontrolowany sposób, zapewniając bardzo specyficzny wynik.

Innym potencjalnym źródłem neoepitopów jest wadliwy splicing. Splicing to podstawowy etap dojrzewania RNA przed sygnałem informacyjnym (mRNA), obsługiwany przez dużą maszynerię makrocząsteczkową zwaną spliceosomem. Spliceosom usuwa introny i liguje flankujące eksony pre-mRNA, dając dojrzałe mRNA. Komórki wykorzystują regulowany alternatywny splicing (AS) wielu eksonów do generowania wielu izoform białek z jednego genu. Jednakże zmieniony program splicingu ulega często deregulacji w komórkach nowotworowych, co stwarza możliwą do wykorzystania podatność na nowotwory, w tym nowotwory mózgu. Profilowanie pierwotnych i nawracających zbiorów danych GBM i niezłośliwych tkanek mózgowych pozwoliło zidentyfikować zdarzenia AS, które są odmiennie regulowane w GBM i które można przełożyć na neoepitopy. Wyniki te sugerują, że modulacja splicingu może stanowić ważną strategię terapeutyczną w przypadku glejaka wielopostaciowego. Rzeczywiście, hamowanie metylotransferazy argininowej PRMT5 w komórkach GBM rozregulowuje splicing i prowadzi do zwiększonej retencji intronów i starzenia się komórek zarówno in vitro, jak i in vivo. Ponadto PRMT5 odgrywa rolę w zachowaniu GSC, które są niezbędne do samoodnowy nowotworu. Ostatnio wykazano, że farmakologiczne hamowanie splicingu generuje immunogenne neoepitopy pochodzące ze splicingu, które są prezentowane przez MHC-I na komórkach nowotworowych i indukują odpowiedź immunologiczną limfocytów T in vivo. Innym potencjalnym celem terapeutycznym jest podjednostka 1 czynnika splicingowego 3b (SF3B1), podstawowy składnik maszyny splicingowej, która ulega nadekspresji w GBM. Podsumowując, wyniki te potwierdzają zasadność badania wpływu środków demetylujących DNA i inhibitorów splicingu w PDO i GSC glejaka w celu zidentyfikowania odpowiednich kandydatów do opracowania nowych strategii terapeutycznych dla tej choroby.

Opisane powyżej podejścia będą stosowane u pacjentów włączonych prospektywnie do badania neurochirurgicznego z powodu glejaka wielopostaciowego. Hodowle neurosfery i PDO zostaną ustalone z tkanki nowotworu pierwotnego. Zastosowane zostaną badania przesiewowe leków i manipulacja komórkami w celu indukowania ekspresji TE i modulowania splicingu. Wyniki testów in vitro zostaną skorelowane z profilem molekularnym nowotworu, odpowiedzią na leczenie i ogólnym wynikiem leczenia pacjenta.