Pasientens avledede organoider for medikamentscreening ved glioblastom (GlioPDO)

Pasientens avledede organoider (PDO) fra tumorkirurgiske biopsier er et innovativt verktøy for å teste individuelle pasienters respons på spesifikke terapeutiske strategier. Organoider er tredimensjonale (3D) strukturer laget av organspesifikke og selvorganiserende celler som kan opprettholdes og forplantes i kultur. Til dags dato har PDOer blitt etablert fra et stort antall krefttyper, inkludert prostata-, eggstok- og brystkreft. Glioblastoma PDOer har også blitt produsert, og de ble vist å opprettholde egenskapene til foreldresvulstene deres, både på mutasjonsnivå og når det gjelder genekspresjonsprofiler og cellulær heterogenitet. Siden de rekapitulerer egenskapene til den opprinnelige svulsten bedre enn GBM-cellelinjer, representerer de et viktig fremskritt for personaliserte medisintilnærminger. Således representerer glioblastom PDO nyttige prekliniske modeller for medikamentscreening, CAR-T-celletesting og for generering av hjerne-ortotopiske xenografter i modellmodeller. I dette perspektivet gir PDO-ene en mulighet til å bedre karakterisere den molekylære heterogeniteten til glioblastompasienter og å teste nye terapeutiske strategier i en kontekst som etterligner genetiske egenskaper hos foreldresvulster.

Immunterapi dukker opp som en kraftig tilnærming mot kreft i noen krefttyper. Immunterapi utnytter immunsystemets evne til å gjenkjenne ikke-selvantigener for å målrette og ødelegge kreftceller. Immunkontrollpunkthemmere (f.eks. anti-PD-1 og anti-CTLA-4 monoklonale antistoffer) ble vist effektive i svulster som viser en høy mutasjonsbyrde, slik som melanom. Dessverre har glioblastom en lav mutasjonsbyrde, noe som resulterer i en liten mengde neoantigener. Dessuten er glioblastom svært heterogent, noe som betyr at ikke alle pasientene produserer de samme antigenene. Dermed kan høyere fordeler oppnås ved å utvikle immunterapier som retter seg mot flere neoantigener og ved å kombinere neoantigengjenkjenningsstrategier med immunkontrollpunktblokkadehemmere. I dette perspektivet kan epigenetisk regulering for å aktivere transkripsjonen av normalt tause transposable elementer (TEs) i glioblastom av DNA-demetylerende midler øke produksjonen av neoantigener og utløse en spesifikk immunrespons.

Transkripsjon av TE-er er lav eller fraværende i de fleste voksne celler, mens den er mer aktiv under embryonal utvikling, i stamceller og, spennende nok, i svulster. TEs de-represjon i svulster skjer gjennom flere epigenetiske endringer i TE-loki, inkludert DNA-demetylering og histon-deacetylering. Begge epigenetiske endringer kan være assosiert med onkogenese, noe som resulterer i forskjellige nivåer av epigenetisk deregulering. TE-overuttrykk i svulster sammenlignet med sunt vev har ført til søket etter anti-TE T-celleresponser i kreft. Proteogenomiske tilnærminger har identifisert tumorspesifikke, ikke-kanoniske åpne leserammer (ORF) som koder for peptider presentert av humant leukocyttantigen (HLA)-I-molekyler på tumorceller. De fleste av de identifiserte peptidene stammer fra ikke-kodende genomiske regioner. Interessant nok finnes noen av disse potensielle tumorspesifikke antigenene hos flere pasienter og kan indusere immunresponser in vitro eller i musemodeller. Vi karakteriserte nylig et langt ikke-kodende RNA (lncRNA) i antisense-retningen til SOD1-genlokus (SOD1-DT), som inkluderer flere transponerbare elementer. Noen av disse (LTR og Alu) inneholder ORF-er og kan potensielt kode for forskjellige epitoper. Ved i silico-oversettelse av disse elementene, identifiserte vi peptider som tilsvarer epitoper som allerede er testet som GBM-spesifikke mål for kreftimmunterapier. Imidlertid er DNA-sekvensen til disse transponerbare elementene sterkt metylert i nervevevet og i U87 GBM-cellelinjen (data fra Genome Browser). Vi vil fokusere på studiet av TE-ene som tilhører LTR12C-familien, fordi de har vist seg å fungere som forsterkerlignende og promoterlignende elementer, og former transkriptomikklandskapet på en vevsspesifikk måte. Det har allerede blitt demonstrert at behandlinger med DNMTi og HDACi ikke endrer uttrykket av kanoniske gener, men induserer de novo transkripsjon av LTR-er, som igjen driver uttrykket av spesifikke gener. I tillegg til å produsere epitopen, ved å aktivere spesifikke LTR-er, er det derfor mulig å aktivere genene knyttet til dem. Spesielt ble LTR12C identifisert som regulator av proapoptotiske gener, slik som TP63 og TNFRSF10B. Dermed kan den foreslåtte strategien representere et generelt anvendelig middel for å produsere proapoptotiske gener og immunogene epitoper på en kontrollert måte, og sikre et veldig spesifikt resultat.

En annen potensiell kilde til neoepitoper er defekt skjøting. Skjøting er et grunnleggende trinn i pre-messenger RNA (mRNA) modning drevet av et stort makromolekylært maskineri kalt spleiseosomet. Spleiseosomet fjerner intronene og ligerer de flankerende eksonene til pre-mRNA-ene, og gir de modne mRNA-ene. Regulert alternativ spleising (AS) av mange eksoner utnyttes av celler for å generere flere proteinisoformer fra et enkelt gen. Imidlertid er det endrede spleiseprogrammet ofte deregulert i kreftceller, og genererer en handlingsbar sårbarhet for svulster, inkludert hjernesvulster. Profilering av primære og tilbakevendende GBM og ikke-maligne hjernevevsdatasett har identifisert AS-hendelser som er forskjellig regulert mellom i GBM og som kan oversettes til neoepitoper. Disse resultatene tyder på at skjøtemodulering kan representere en gyldig terapeutisk strategi for glioblastom. Faktisk dysregulerer hemming av argininmetyltransferasen PRMT5 i GBM-celler spleising og fører til økt intronretensjon og cellealderdom både in vitro og in vivo. Videre har PRMT5 en rolle i bevaring av GSC-er, som er nødvendige for selvfornyelse av tumor. Nylig ble det vist at farmakologisk hemming av spleising genererer spleisingsavledede immunogene neoepitoper, som presenteres av MHC-I på tumorceller og induserer en T-celle-immunrespons in vivo. Et annet potensielt terapeutisk mål er Splicing Factor 3b Subunit 1 (SF3B1), en kjernekomponent i spleisemaskineriet som er overuttrykt i GBM. Til sammen støtter disse resultatene begrunnelsen for å studere effekten av DNA-demetylerende midler og spleisehemmere i glioblastom PDO og GSC for å identifisere egnede kandidater for å utvikle nye terapeutiske strategier for denne sykdommen.

De ovenfor beskrevne tilnærmingene vil bli brukt på prospektivt innrullerte pasienter som gjennomgår nevrokirurgi for glioblastom. Neurosfærekulturer og PDO vil bli etablert fra primært tumorvev. Legemiddelscreening og cellemanipulasjon for å indusere TE-ekspresjon og for å modulere spleising vil bli brukt. Resultatene av in vitro-tester vil være korrelert med tumormolekylær profil, respons på behandlinger og det totale pasientresultatet.