Organoidi derivati ​​dal paziente per lo screening farmacologico nel glioblastoma (GlioPDO)

Gli organoidi derivati ​​dal paziente (PDO) da biopsie chirurgiche tumorali sono uno strumento innovativo per testare la risposta dei singoli pazienti a specifiche strategie terapeutiche. Gli organoidi sono strutture tridimensionali (3D) costituite da cellule organo-specifiche e auto-organizzanti che possono essere mantenute e propagate in coltura. Ad oggi, sono state stabilite DOP per un gran numero di tipi di cancro, compresi i tumori della prostata, dell’ovaio e della mammella. Sono stati prodotti anche glioblastomi PDO, che hanno dimostrato di mantenere le caratteristiche dei tumori originari, sia a livello mutazionale che in termini di profili di espressione genica ed eterogeneità cellulare. Poiché riassumono le caratteristiche del tumore originale meglio delle linee cellulari GBM, rappresentano un importante progresso per gli approcci di medicina personalizzata. Pertanto, i PDO del glioblastoma rappresentano utili modelli preclinici per lo screening farmacologico, il test delle cellule CAR-T e per la generazione di xenotrapianti ortotopici cerebrali in modelli modello. In questa prospettiva, i PDO offrono l'opportunità di caratterizzare meglio l'eterogeneità molecolare dei pazienti con glioblastoma e di testare nuove strategie terapeutiche in un contesto che imita le proprietà genetiche del tumore genitore.

L’immunoterapia sta emergendo come un potente approccio antitumorale in alcuni tipi di cancro. L’immunoterapia sfrutta la capacità del sistema immunitario di riconoscere gli antigeni non self per colpire e distruggere le cellule tumorali. Inibitori dei checkpoint immunitari (es. anticorpi monoclonali anti-PD-1 e anti-CTLA-4) si sono dimostrati efficaci nei tumori che presentano un elevato carico mutazionale, come il melanoma. Sfortunatamente, il glioblastoma ha un basso carico mutazionale, risultando in una piccola quantità di neoantigeni. Inoltre, il glioblastoma è altamente eterogeneo, nel senso che non tutti i pazienti producono gli stessi antigeni. Pertanto, si potrebbero ottenere maggiori benefici sviluppando immunoterapie mirate a più neoantigeni e combinando strategie di riconoscimento dei neoantigeni con inibitori del blocco del checkpoint immunitario. In questa prospettiva, la regolazione epigenetica per attivare la trascrizione di elementi trasponibili (TE) normalmente silenziosi nel glioblastoma da parte di agenti demetilanti il ​​DNA può aumentare la produzione di neoantigeni e innescare una risposta immunitaria specifica.

La trascrizione dei TE è bassa o assente nella maggior parte delle cellule adulte, mentre è più attiva durante lo sviluppo embrionale, nelle cellule staminali e, cosa interessante, nei tumori. La de-repressione dei TE nei tumori avviene attraverso molteplici cambiamenti epigenetici nei loci TE, tra cui la demetilazione del DNA e la deacetilazione degli istoni. Entrambi i cambiamenti epigenetici possono essere associati all'oncogenesi, determinando diversi livelli di deregolamentazione epigenetica. La sovraespressione di TE nei tumori rispetto ai tessuti sani ha spinto alla ricerca di risposte delle cellule T anti-TE nel cancro. Gli approcci proteogenomici hanno identificato frame di lettura aperti (ORF) specifici per il tumore e non canonici che codificano i peptidi presentati dalle molecole dell'antigene leucocitario umano (HLA) -I sulle cellule tumorali. La maggior parte dei peptidi identificati derivano da regioni genomiche non codificanti. È interessante notare che alcuni di questi potenziali antigeni tumore-specifici si trovano in più pazienti e possono indurre risposte immunitarie in vitro o in modelli murini. Recentemente abbiamo caratterizzato un lungo RNA non codificante (lncRNA) nella direzione antisenso del locus del gene SOD1 (SOD1-DT), che include diversi elementi trasponibili. Alcuni di questi (LTR e Alu) contengono ORF e potrebbero potenzialmente codificare epitopi diversi. Mediante la traduzione in silico di questi elementi, abbiamo identificato peptidi corrispondenti a epitopi già testati come bersagli specifici del GBM per le immunoterapie contro il cancro. Tuttavia, la sequenza del DNA di questi elementi trasponibili è altamente metilata nel tessuto nervoso e nella linea cellulare GBM U87 (dati da Genome Browser). Ci concentreremo sullo studio dei TE appartenenti alla famiglia LTR12C, perché è stato dimostrato che agiscono come elementi simil-enhancer e simil-promotore, modellando il panorama della trascrittomica in modo tessuto-specifico. È stato già dimostrato che i trattamenti con DNMTi e HDACi non alterano l'espressione di geni canonici ma inducono la trascrizione de novo di LTR, che a loro volta guidano l'espressione di geni specifici. Oltre a produrre l'epitopo, attivando specifiche LTR, è quindi possibile attivare i geni ad essi collegati. In particolare, LTR12C è stato identificato come regolatore di geni proapoptotici, come TP63 e TNFRSF10B. Pertanto, la strategia proposta potrebbe rappresentare un mezzo generalmente applicabile per produrre geni proapoptotici ed epitopi immunogenici in modo controllato, garantendo un risultato molto specifico.

Un'altra potenziale fonte di neoepitopi è lo splicing difettoso. Lo splicing è un passaggio fondamentale nella maturazione dell'RNA pre-messaggero (mRNA) operato da un grande macchinario macromolecolare chiamato spliceosoma. Lo spliceosoma rimuove gli introni e lega gli esoni fiancheggianti dei pre-mRNA, producendo gli mRNA maturi. Lo splicing alternativo regolato (AS) di molti esoni viene sfruttato dalle cellule per generare più isoforme proteiche da un singolo gene. Tuttavia, il programma di splicing alterato è spesso deregolamentato nelle cellule tumorali, generando una vulnerabilità perseguibile per i tumori, compresi i tumori cerebrali. La profilazione dei set di dati del GBM primario e ricorrente e dei tessuti cerebrali non maligni ha identificato eventi AS che sono regolati in modo diverso nel GBM e che potrebbero essere tradotti in neoepitopi. Questi risultati suggeriscono che la modulazione dello splicing potrebbe rappresentare una valida strategia terapeutica per il glioblastoma. Infatti, l'inibizione dell'arginina metil transferasi PRMT5 nelle cellule GBM disregola lo splicing e porta ad un aumento della ritenzione degli introni e della senescenza cellulare sia in vitro che in vivo. Inoltre, PRMT5 ha un ruolo nella conservazione delle GSC, necessarie per l'autorinnovamento del tumore. Recentemente, è stato dimostrato che l'inibizione farmacologica dello splicing genera neoepitopi immunogenici derivati ​​dallo splicing, che sono presentati da MHC-I sulle cellule tumorali e inducono una risposta immunitaria delle cellule T in vivo. Un altro potenziale bersaglio terapeutico è la subunità 1 del fattore di splicing 3b (SF3B1), un componente fondamentale del meccanismo di splicing che è sovraespresso nel GBM. Nel loro insieme, questi risultati supportano la logica dello studio degli effetti degli agenti demetilanti del DNA e degli inibitori dello splicing nei PDO e GSC del glioblastoma per identificare candidati idonei per sviluppare nuove strategie terapeutiche per questa malattia.

Gli approcci sopra descritti verranno applicati a pazienti potenzialmente arruolati sottoposti a neurochirurgia per glioblastoma. Colture di neurosfere e PDO verranno ottenute dal tessuto tumorale primario. Verranno applicati screening farmacologici e manipolazione cellulare per indurre l'espressione di TE e modulare lo splicing. I risultati dei test in vitro saranno correlati al profilo molecolare del tumore, alla risposta ai trattamenti e all'esito complessivo dei pazienti.