Vom Patienten abgeleitete Organoide für das Arzneimittelscreening bei Glioblastomen (GlioPDO)

Von Patienten abgeleitete Organoide (PDOs) aus chirurgischen Tumorbiopsien sind ein innovatives Instrument, um die Reaktion einzelner Patienten auf bestimmte Therapiestrategien zu testen. Organoide sind dreidimensionale (3D) Strukturen aus organspezifischen und selbstorganisierenden Zellen, die in Kultur erhalten und vermehrt werden können. Bisher wurden PDOs für eine Vielzahl von Krebsarten etabliert, darunter Prostata-, Eierstock- und Brustkrebs. Es wurden auch Glioblastom-PDOs hergestellt, und es wurde gezeigt, dass sie die Eigenschaften ihrer Ausgangstumoren beibehalten, sowohl auf Mutationsebene als auch im Hinblick auf Genexpressionsprofile und zelluläre Heterogenität. Da sie die Eigenschaften des ursprünglichen Tumors besser nachbilden als GBM-Zelllinien, stellen sie einen wichtigen Fortschritt für Ansätze der personalisierten Medizin dar. Somit stellen Glioblastom-PDOs nützliche präklinische Modelle für das Arzneimittelscreening, CAR-T-Zelltests und für die Erzeugung orthotopischer Xenotransplantate des Gehirns in Modellmodellen dar. Aus dieser Perspektive bieten die PDOs die Möglichkeit, die molekulare Heterogenität von Glioblastompatienten besser zu charakterisieren und neue Therapiestrategien in einem Kontext zu testen, der die genetischen Eigenschaften des Elterntumors nachahmt.

Bei einigen Krebsarten entwickelt sich die Immuntherapie zu einem wirkungsvollen Ansatz zur Krebsbekämpfung. Die Immuntherapie nutzt die Fähigkeit des Immunsystems, nicht-eigene Antigene zu erkennen, um Krebszellen anzugreifen und zu zerstören. Immun-Checkpoint-Inhibitoren (z. B. monoklonale Anti-PD-1- und Anti-CTLA-4-Antikörper) erwiesen sich bei Tumoren mit hoher Mutationslast wie Melanomen als wirksam. Leider weist das Glioblastom eine geringe Mutationslast auf, was zu einer geringen Menge an Neoantigenen führt. Darüber hinaus ist das Glioblastom sehr heterogen, was bedeutet, dass nicht alle Patienten die gleichen Antigene produzieren. Somit könnten größere Vorteile durch die Entwicklung von Immuntherapien erzielt werden, die auf mehrere Neoantigene abzielen, und durch die Kombination von Neoantigen-Erkennungsstrategien mit Immun-Checkpoint-Blockade-Inhibitoren. Aus dieser Perspektive kann die epigenetische Regulation zur Aktivierung der Transkription normalerweise stiller transponierbarer Elemente (TEs) im Glioblastom durch DNA-Demethylierungsmittel die Produktion von Neoantigenen steigern und eine spezifische Immunantwort auslösen.

Die Transkription von TEs ist in den meisten erwachsenen Zellen gering oder fehlt, während sie während der Embryonalentwicklung, in Stammzellen und interessanterweise auch in Tumoren aktiver ist. Die Unterdrückung von TEs in Tumoren erfolgt durch mehrere epigenetische Veränderungen an TE-Loci, einschließlich DNA-Demethylierung und Histon-Deacetylierung. Beide epigenetischen Veränderungen können mit der Onkogenese verbunden sein, was zu unterschiedlichem Ausmaß epigenetischer Deregulierung führt. Die Überexpression von TEs in Tumoren im Vergleich zu gesundem Gewebe hat die Suche nach Anti-TE-T-Zell-Reaktionen bei Krebs ausgelöst. Proteogenomische Ansätze haben tumorspezifische, nicht-kanonische offene Leserahmen (ORFs) identifiziert, die Peptide kodieren, die von humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-I-Molekülen auf Tumorzellen präsentiert werden. Die meisten der identifizierten Peptide stammen aus nicht-kodierenden Genomregionen. Interessanterweise kommen einige dieser potenziellen tumorspezifischen Antigene bei mehreren Patienten vor und können in vitro oder in Mausmodellen Immunreaktionen auslösen. Wir haben kürzlich eine lange nichtkodierende RNA (lncRNA) in der Antisense-Richtung des SOD1-Genlocus (SOD1-DT) charakterisiert, die mehrere transponierbare Elemente enthält. Einige davon (LTR und Alu) enthalten ORFs und könnten möglicherweise verschiedene Epitope kodieren. Durch In-silico-Translation dieser Elemente identifizierten wir Peptide, die Epitopen entsprechen, die bereits als GBM-spezifische Ziele für Krebsimmuntherapien getestet wurden. Allerdings ist die DNA-Sequenz dieser transponierbaren Elemente im Nervengewebe und in der U87-GBM-Zelllinie stark methyliert (Daten von Genome Browser). Wir werden uns auf die Untersuchung der zur LTR12C-Familie gehörenden TEs konzentrieren, da gezeigt wurde, dass sie als Enhancer-ähnliche und Promotor-ähnliche Elemente fungieren und die Transkriptomiklandschaft auf gewebespezifische Weise prägen. Es wurde bereits gezeigt, dass Behandlungen mit DNMTi und HDACi die Expression kanonischer Gene nicht verändern, sondern die De-novo-Transkription von LTRs induzieren, die wiederum die Expression spezifischer Gene steuern. Neben der Produktion des Epitops ist es daher durch die Aktivierung spezifischer LTRs möglich, die damit verbundenen Gene zu aktivieren. Insbesondere wurde LTR12C als Regulator proapoptotischer Gene wie TP63 und TNFRSF10B identifiziert. Somit könnte die vorgeschlagene Strategie ein allgemein anwendbares Mittel darstellen, um proapoptotische Gene und immunogene Epitope auf kontrollierte Weise zu produzieren und so ein sehr spezifisches Ergebnis zu gewährleisten.

Eine weitere mögliche Quelle für Neoepitope ist fehlerhaftes Spleißen. Das Spleißen ist ein grundlegender Schritt bei der Reifung der Pre-Messenger-RNA (mRNA), die von einer großen makromolekularen Maschinerie namens Spleißosom gesteuert wird. Das Spleißosom entfernt die Introns und ligiert die flankierenden Exons der Prä-mRNAs, wodurch die reifen mRNAs entstehen. Das regulierte alternative Spleißen (AS) vieler Exons wird von Zellen genutzt, um aus einem einzigen Gen mehrere Proteinisoformen zu erzeugen. Allerdings ist das veränderte Spleißprogramm in Krebszellen häufig dereguliert, was zu einer verwertbaren Anfälligkeit für Tumore, einschließlich Hirntumoren, führt. Durch die Profilierung primärer und rezidivierender GBM- und nicht-maligner Hirngewebe-Datensätze wurden AS-Ereignisse identifiziert, die bei GBM unterschiedlich reguliert werden und in Neoepitope übersetzt werden könnten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Spleißmodulation eine gültige Therapiestrategie für Glioblastome darstellen könnte. Tatsächlich führt die Hemmung der Argininmethyltransferase PRMT5 in GBM-Zellen zu einer Fehlregulierung des Spleißens und führt sowohl in vitro als auch in vivo zu einer erhöhten Intronretention und Zellalterung. Darüber hinaus spielt PRMT5 eine Rolle bei der Erhaltung von GSCs, die für die Selbsterneuerung des Tumors notwendig sind. Kürzlich wurde gezeigt, dass die pharmakologische Hemmung des Spleißens vom Spleißen abgeleitete immunogene Neoepitope erzeugt, die von MHC-I auf Tumorzellen präsentiert werden und in vivo eine T-Zell-Immunantwort auslösen. Ein weiteres potenzielles therapeutisches Ziel ist die Spleißfaktor-3b-Untereinheit 1 (SF3B1), eine Kernkomponente der Spleißmaschinerie, die in GBM überexprimiert wird. Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Überlegung, die Auswirkungen von DNA-Demethylierungsmitteln und Spleißinhibitoren in Glioblastom-PDOs und GSCs zu untersuchen, um geeignete Kandidaten für die Entwicklung neuer Therapiestrategien für diese Krankheit zu identifizieren.

Die oben beschriebenen Ansätze werden auf prospektiv aufgenommene Patienten angewendet, die sich einer Neurochirurgie wegen Glioblastoms unterziehen. Neurosphärenkulturen und PDO werden aus primärem Tumorgewebe etabliert. Es werden Wirkstoffscreening und Zellmanipulation zur Induktion der TE-Expression und zur Modulation des Spleißens eingesetzt. Die Ergebnisse der In-vitro-Tests werden mit dem molekularen Profil des Tumors, dem Ansprechen auf Behandlungen und dem Gesamtergebnis des Patienten korreliert.