Patientens härledda organoider för läkemedelsscreening vid glioblastom (GlioPDO)

Patient's Derived Organoids (PDO) från tumörkirurgiska biopsier är ett innovativt verktyg för att testa individuella patienters svar på specifika terapeutiska strategier. Organoider är tredimensionella (3D) strukturer gjorda av organspecifika och självorganiserande celler som kan upprätthållas och förökas i kultur. Hittills har PDO etablerats från ett stort antal cancertyper, inklusive prostatacancer, äggstockscancer och bröstcancer. Glioblastom PDO har också producerats, och de visades bibehålla egenskaperna hos sina modertumörer, både på mutationsnivå och när det gäller genuttrycksprofiler och cellulär heterogenitet. Eftersom de rekapitulerar egenskaperna hos den ursprungliga tumören bättre än GBM-cellinjer, representerar de ett viktigt framsteg för personliga medicinska metoder. Således representerar glioblastom PDO användbara prekliniska modeller för läkemedelsscreening, CAR-T-celltestning och för generering av hjärnortotopiska xenotransplantat i modellmodeller. I detta perspektiv erbjuder PDO:erna en möjlighet att bättre karakterisera den molekylära heterogeniteten hos glioblastompatienter och att testa nya terapeutiska strategier i ett sammanhang som efterliknar genetiska egenskaper hos föräldrarnas tumör.

Immunterapi håller på att dyka upp som ett kraftfullt anticancermetod i vissa cancertyper. Immunterapi utnyttjar immunsystemets förmåga att känna igen icke-självantigener för att rikta in sig på och förstöra cancerceller. Immuncheckpointshämmare (t.ex. anti-PD-1 och anti-CTLA-4 monoklonala antikroppar) visade sig vara effektiva i tumörer som uppvisar en hög mutationsbörda, såsom melanom. Tyvärr har glioblastom en låg mutationsbörda, vilket resulterar i en liten mängd neoantigener. Dessutom är glioblastom mycket heterogent, vilket innebär att inte alla patienter producerar samma antigener. Sålunda kan högre fördelar uppnås genom att utveckla immunterapier som riktar sig mot flera neoantigener och genom att kombinera neoantigenigenkänningsstrategier med immunkontrollpunktsblockadshämmare. I detta perspektiv kan epigenetisk reglering för att aktivera transkriptionen av normalt tysta transposerbara element (TE) i glioblastom av DNA-demetylerande medel öka produktionen av neoantigener och utlösa ett specifikt immunsvar.

Transkription av TEs är låg eller saknas i de flesta vuxna celler, medan den är mer aktiv under embryonal utveckling, i stamceller och, spännande nog, i tumörer. TEs de-repression i tumörer sker genom flera epigenetiska förändringar av TE-loci, inklusive DNA-demetylering och histon-deacetylering. Båda epigenetiska förändringarna kan associeras med onkogenes, vilket resulterar i olika nivåer av epigenetisk avreglering. TEs överuttryck i tumörer jämfört med frisk vävnad har föranlett sökandet efter anti-TE T-cellsvar i cancer. Proteogenomiska tillvägagångssätt har identifierat tumörspecifika, icke-kanoniska öppna läsramar (ORF) som kodar för peptider som presenteras av humant leukocytantigen (HLA)-I-molekyler på tumörceller. De flesta av de identifierade peptiderna härrörande från icke-kodande genomiska regioner. Intressant nog finns några av dessa potentiella tumörspecifika antigener i flera patienter och kan inducera immunsvar in vitro eller i musmodeller. Vi karakteriserade nyligen ett långt icke-kodande RNA (lncRNA) i antisensriktningen för SOD1-genlokus (SOD1-DT), som inkluderar flera transposerbara element. Vissa av dessa (LTR och Alu) innehåller ORF och kan potentiellt koda för olika epitoper. Genom silico translation av dessa element identifierade vi peptider som motsvarar epitoper som redan testats som GBM-specifika mål för cancerimmunterapier. DNA-sekvensen för dessa transposerbara element är dock starkt metylerad i nervvävnaden och i U87 GBM-cellinjen (data från Genome Browser). Vi kommer att fokusera på studien av TE:er som tillhör LTR12C-familjen, eftersom de har visat sig fungera som förstärkarliknande och promotorliknande element, som formar transkriptomiklandskapet på ett vävnadsspecifikt sätt. Det har redan visat sig att behandlingar med DNMTi och HDACi inte förändrar uttrycket av kanoniska gener utan inducerar de novo-transkription av LTR, vilket i sin tur driver uttrycket av specifika gener. Förutom att producera epitopen, genom att aktivera specifika LTR, är det därför möjligt att aktivera de gener som är kopplade till dem. Noterbart identifierades LTR12C som regulator av proapoptotiska gener, såsom TP63 och TNFRSF10B. Således kan den föreslagna strategin representera ett allmänt tillämpbart sätt att producera proapoptotiska gener och immunogena epitoper på ett kontrollerat sätt, vilket säkerställer ett mycket specifikt resultat.

En annan potentiell källa till neoepitoper är defekt skarvning. Splitsning är ett grundläggande steg i pre-messenger RNA (mRNA) mognad som drivs av ett stort makromolekylärt maskineri som heter spliceosomen. Splitsosomen tar bort intronerna och ligerar de flankerande exonerna av pre-mRNA, vilket ger mogna mRNA. Reglerad alternativ splitsning (AS) av många exoner utnyttjas av celler för att generera flera proteinisoformer från en enda gen. Det ändrade splitsningsprogrammet avregleras dock ofta i cancerceller, vilket skapar en åtgärdsbar sårbarhet för tumörer, inklusive hjärntumörer. Profilering av primära och återkommande GBM och icke-maligna hjärnvävnadsdatauppsättningar har identifierat AS-händelser som är olika reglerade i GBM och som kan översättas till neoepitoper. Dessa resultat tyder på att splitsningsmodulering kan representera en giltig terapeutisk strategi för glioblastom. Faktum är att hämning av argininmetyltransferaset PRMT5 i GBM-celler dysregulerar splitsning och leder till ökad intronretention och cellåldring både in vitro och in vivo. Dessutom har PRMT5 en roll i bevarandet av GSC, som är nödvändiga för tumörs självförnyelse. Nyligen visades det att farmakologisk hämning av splitsning genererar splitsningshärledda immunogena neopitoper, som presenteras av MHC-I på tumörceller och inducerar ett T-cellsimmunsvar in vivo. Ett annat potentiellt terapeutiskt mål är Splicing Factor 3b Subunit 1 (SF3B1), en kärnkomponent i splitsningsmaskineriet som är överuttryckt i GBM. Sammantaget stödjer dessa resultat logiken för att studera effekterna av DNA-demetylerande medel och splitsningsinhibitorer i glioblastom PDO och GSC för att identifiera lämpliga kandidater för att utveckla nya terapeutiska strategier för denna sjukdom.

De ovan beskrivna tillvägagångssätten kommer att tillämpas på prospektivt inskrivna patienter som genomgår neurokirurgi för glioblastom. Neurosfärskulturer och PDO kommer att etableras från primär tumörvävnad. Läkemedelsscreening och cellmanipulation för att inducera TE-expression och för att modulera splitsning kommer att tillämpas. Resultaten av in vitro-tester kommer att korreleras med tumörmolekylär profil, svar på behandlingar och övergripande patientresultat.