Organoidy odvozené od pacienta pro screening léků u glioblastomu (GlioPDO)

Organoidy odvozené od pacienta (PDO) z chirurgických biopsií nádoru jsou inovativním nástrojem k testování reakce jednotlivých pacientů na specifické terapeutické strategie. Organoidy jsou trojrozměrné (3D) struktury vyrobené z orgánově specifických a samoorganizujících se buněk, které lze udržovat a množit v kultuře. K dnešnímu dni byly CHOP stanoveny z velkého počtu typů rakoviny, včetně rakoviny prostaty, vaječníků a prsu. Glioblastomové PDO byly také produkovány a bylo prokázáno, že si zachovávají vlastnosti svých rodičovských nádorů, a to jak na mutační úrovni, tak ve smyslu profilů genové exprese a buněčné heterogenity. Protože rekapitulují vlastnosti původního nádoru lépe než buněčné linie GBM, představují důležitý pokrok pro přístupy personalizované medicíny. Glioblastomové PDO tedy představují užitečné předklinické modely pro screening léků, testování CAR-T buněk a pro generování mozkových ortotopických xenograftů v modelových modelech. V této perspektivě nabízejí PDO příležitost lépe charakterizovat molekulární heterogenitu pacientů s glioblastomem a testovat nové terapeutické strategie v kontextu, který napodobuje genetické vlastnosti původního nádoru.

Imunoterapie se objevuje jako účinný protirakovinný přístup u některých typů rakoviny. Imunoterapie využívá schopnost imunitního systému rozpoznat ne-vlastní antigeny k zacílení a zničení rakovinných buněk. Inhibitory imunitních kontrolních bodů (např. anti-PD-1 a anti-CTLA-4 monoklonální protilátky) se ukázaly jako účinné u nádorů vykazujících vysokou mutační zátěž, jako je melanom. Glioblastom má bohužel nízkou mutační zátěž, což má za následek malé množství neoantigenů. Glioblastom je navíc vysoce heterogenní, což znamená, že ne všichni pacienti produkují stejné antigeny. Vyšších přínosů by tedy bylo možné dosáhnout vývojem imunoterapií, které se zaměřují na více neoantigenů, a kombinací strategií rozpoznávání neoantigenů s inhibitory blokády imunitního kontrolního bodu. V této perspektivě může epigenetická regulace k aktivaci transkripce normálně tichých transponovatelných elementů (TE) v glioblastomu činidly demetylujícími DNA zvýšit produkci neoantigenů a spustit specifickou imunitní odpověď.

Transkripce TE je nízká nebo chybí ve většině dospělých buněk, zatímco je aktivnější během embryonálního vývoje, v kmenových buňkách a, což je zajímavé, v nádorech. Dereprese TE v nádorech nastává prostřednictvím četných epigenetických změn lokusů TE, včetně demetylace DNA a deacetylace histonů. Obě epigenetické změny mohou být spojeny s onkogenezí, což vede k různým úrovním epigenetické deregulace. Nadměrná exprese TE v nádorech ve srovnání se zdravou tkání podnítila hledání odpovědí anti-TE T buněk u rakoviny. Proteogenomické přístupy identifikovaly nádorově specifické, nekanonické otevřené čtecí rámce (ORF), které kódují peptidy prezentované molekulami lidského leukocytárního antigenu (HLA)-I na nádorových buňkách. Většina identifikovaných peptidů pochází z nekódujících genomových oblastí. Je zajímavé, že některé z těchto potenciálních nádorově specifických antigenů se nacházejí u mnoha pacientů a mohou indukovat imunitní reakce in vitro nebo na myších modelech. Nedávno jsme charakterizovali dlouhou nekódující RNA (lncRNA) v antisense směru lokusu genu SOD1 (SOD1-DT), která obsahuje několik transponovatelných prvků. Některé z nich (LTR a Alu) obsahují ORF a mohly by potenciálně kódovat různé epitopy. Pomocí in silico translace těchto prvků jsme identifikovali peptidy odpovídající epitopům již testovaným jako GBM-specifické cíle pro imunoterapii rakoviny. Sekvence DNA těchto transponovatelných prvků je však vysoce metylovaná v nervové tkáni a v buněčné linii U87 GBM (data z Genome Browser). Zaměříme se na studium TE patřících do rodiny LTR12C, protože se ukázalo, že působí jako prvky podobné zesilovačům a promotorům, které utvářejí krajinu transkriptomiky tkáňově specifickým způsobem. Již bylo prokázáno, že ošetření pomocí DNMTi a HDACi nemění expresi kanonických genů, ale indukuje de novo transkripci LTR, které zase řídí expresi specifických genů. Kromě produkce epitopu je tedy možné aktivací specifických LTR aktivovat geny s nimi spojené. Je pozoruhodné, že LTR12C byl identifikován jako regulátor proapoptotických genů, jako je TP63 a TNFRSF10B. Navržená strategie by tedy mohla představovat obecně použitelný prostředek k produkci proapoptotických genů a imunogenních epitopů kontrolovaným způsobem, zajišťujícím velmi specifický výsledek.

Dalším potenciálním zdrojem neoepitopů je defektní sestřih. Sestřih je základním krokem v pre-messenger RNA (mRNA) zrání, který provozuje velký makromolekulární aparát zvaný spliceosom. Spliceosom odstraní introny a liguje lemující exony pre-mRNA, čímž se získají zralé mRNA. Regulovaný alternativní sestřih (AS) mnoha exonů je využíván buňkami k vytvoření více izoforem proteinu z jednoho genu. Změněný program sestřihu je však v rakovinných buňkách často deregulován, což vytváří zranitelnost pro nádory, včetně nádorů mozku. Profilování primárních a rekurentních datových souborů GBM a nemaligních mozkových tkání identifikovalo AS události, které jsou v GBM různě regulovány a které by mohly být převedeny do neoepitopů. Tyto výsledky naznačují, že modulace sestřihu by mohla představovat platnou terapeutickou strategii pro glioblastom. Inhibice arginin methyl transferázy PRMT5 v buňkách GBM skutečně narušuje sestřih a vede ke zvýšené retenci intronů a stárnutí buněk jak in vitro, tak in vivo. Kromě toho má PRMT5 roli při zachování GSC, které jsou nezbytné pro samoobnovu nádoru. Nedávno se ukázalo, že farmakologická inhibice sestřihu generuje imunogenní neoepitopy odvozené ze sestřihu, které jsou prezentovány MHC-I na nádorových buňkách a indukují imunitní odpověď T buněk in vivo. Dalším potenciálním terapeutickým cílem je podjednotka 1 sestřihového faktoru 3b (SF3B1), hlavní složka sestřihového aparátu, která je nadměrně exprimována v GBM. Dohromady tyto výsledky podporují zdůvodnění studia účinků činidel demetylujících DNA a inhibitorů sestřihu u glioblastomových PDO a GSC za účelem identifikace vhodných kandidátů pro vývoj nových terapeutických strategií pro toto onemocnění.

Výše popsané přístupy budou aplikovány na prospektivně zařazené pacienty podstupující neurochirurgický výkon pro glioblastom. Kultury neurosféry a PDO budou založeny z primární nádorové tkáně. Bude použit screening léků a manipulace s buňkami k indukci exprese TE a modulaci sestřihu. Výsledky testů in vitro budou korelovány s molekulárním profilem nádoru, odpovědí na léčbu a celkovým výsledkem pacienta.