Organoides derivados do paciente para triagem de drogas em glioblastoma (GlioPDO)

Os Organóides Derivados do Paciente (PDOs) de biópsias cirúrgicas de tumores são uma ferramenta inovadora para testar a resposta de pacientes individuais a estratégias terapêuticas específicas. Organóides são estruturas tridimensionais (3D) feitas de células específicas de órgãos e auto-organizadas que podem ser mantidas e propagadas em cultura. Até à data, foram estabelecidas DOP a partir de um grande número de tipos de cancro, incluindo cancro da próstata, ovário e mama. Também foram produzidos PDOs de glioblastoma e foi demonstrado que mantêm as características dos tumores parentais, tanto a nível mutacional como em termos de perfis de expressão genética e heterogeneidade celular. Uma vez que recapitulam melhor as características do tumor original do que as linhas celulares GBM, representam um avanço importante para abordagens de medicina personalizada. Assim, os DOPs de glioblastoma representam modelos pré-clínicos úteis para triagem de drogas, testes de células CAR-T e para a geração de xenoenxertos ortotópicos cerebrais em modelos modelo . Nesta perspectiva, as DOP oferecem uma oportunidade para melhor caracterizar a heterogeneidade molecular dos pacientes com glioblastoma e para testar novas estratégias terapêuticas num contexto que mimetiza as propriedades genéticas do tumor parental.

A imunoterapia está emergindo como uma poderosa abordagem anticancerígena em alguns tipos de câncer. A imunoterapia explora a capacidade do sistema imunológico de reconhecer antígenos não próprios para atingir e destruir células cancerígenas. Inibidores de pontos de controle imunológico (por ex. anticorpos monoclonais anti-PD-1 e anti-CTLA-4) mostraram-se eficazes em tumores que apresentam uma elevada carga mutacional, tal como o melanoma. Infelizmente, o glioblastoma apresenta baixa carga mutacional, resultando em pequena quantidade de neoantígenos. Além disso, o glioblastoma é altamente heterogêneo, o que significa que nem todos os pacientes produzem os mesmos antígenos. Assim, maiores benefícios poderiam ser alcançados através do desenvolvimento de imunoterapias que tenham como alvo múltiplos neoantígenos e combinando estratégias de reconhecimento de neoantígenos com inibidores de bloqueio de pontos de controle imunológico. Nessa perspectiva, a regulação epigenética para ativar a transcrição de elementos transponíveis (TEs) normalmente silenciosos no glioblastoma por agentes desmetilantes de DNA pode aumentar a produção de neoantígenos e desencadear uma resposta imune específica.

A transcrição de TEs é baixa ou ausente na maioria das células adultas, embora seja mais ativa durante o desenvolvimento embrionário, nas células-tronco e, curiosamente, nos tumores. A desrepressão de TEs em tumores ocorre através de múltiplas alterações epigenéticas em loci TE, incluindo desmetilação de DNA e desacetilação de histonas. Ambas as alterações epigenéticas podem estar associadas à oncogênese, resultando em diferentes níveis de desregulação epigenética. A superexpressão de TEs em tumores em comparação com tecidos saudáveis ​​levou à busca por respostas de células T anti-TE no câncer. Abordagens proteogenômicas identificaram estruturas de leitura aberta não canônicas (ORFs) específicas do tumor que codificam peptídeos apresentados por moléculas de antígeno leucocitário humano (HLA) -I em células tumorais. A maioria dos peptídeos identificados deriva de regiões genômicas não codificantes. Curiosamente, alguns destes potenciais antígenos específicos do tumor são encontrados em vários pacientes e podem induzir respostas imunes in vitro ou em modelos de camundongos. Recentemente caracterizamos um longo RNA não codificante (lncRNA) na direção antisense do locus do gene SOD1 (SOD1-DT), que inclui vários elementos transponíveis. Alguns destes (LTR e Alu) contêm ORFs e podem potencialmente codificar diferentes epítopos. Pela tradução in silico desses elementos, identificamos peptídeos correspondentes a epítopos já testados como alvos específicos de GBM para imunoterapias contra o câncer. No entanto, a sequência de ADN destes elementos transponíveis é altamente metilada no tecido nervoso e na linha celular U87 GBM (dados do Genome Browser). Vamos nos concentrar no estudo dos TEs pertencentes à família LTR12C, porque foi demonstrado que eles atuam como elementos semelhantes a intensificadores e promotores, moldando a paisagem transcriptômica de uma maneira específica do tecido. Já foi demonstrado que os tratamentos com DNMTi e HDACi não alteram a expressão de genes canônicos, mas induzem a transcrição de novo de LTRs, que por sua vez impulsionam a expressão de genes específicos. Além de produzir o epítopo, através da ativação de LTRs específicos, é portanto possível ativar os genes a eles ligados. Notavelmente, o LTR12C foi identificado como regulador de genes pró-apoptóticos, como TP63 e TNFRSF10B. Assim, a estratégia proposta poderia representar um meio geralmente aplicável para produzir genes pró-apoptóticos e epítopos imunogênicos de maneira controlada, garantindo um resultado muito específico.

Outra fonte potencial de neoepítopos é o splicing defeituoso. O splicing é uma etapa fundamental na maturação do RNA pré-mensageiro (mRNA), operada por uma grande maquinaria macromolecular chamada spliceossomo. O spliceossomo remove os íntrons e liga os éxons flanqueadores dos pré-mRNAs, produzindo os mRNAs maduros. O splicing alternativo regulado (AS) de muitos exons é explorado pelas células para gerar múltiplas isoformas de proteínas a partir de um único gene. No entanto, o programa de splicing alterado é frequentemente desregulado nas células cancerígenas, gerando uma vulnerabilidade acionável para tumores, incluindo tumores cerebrais. O perfil de conjuntos de dados de tecidos cerebrais primários e recorrentes de GBM e não malignos identificou eventos de EA que são regulados de maneira diferente no GBM e que podem ser traduzidos em neoepítopos. Estes resultados sugerem que a modulação do splicing pode representar uma estratégia terapêutica válida para o glioblastoma. De facto, a inibição da arginina metil transferase PRMT5 em células GBM desregula o splicing e leva ao aumento da retenção de intrões e à senescência celular tanto in vitro como in vivo. Além disso, o PRMT5 tem um papel na preservação das GSCs, que são necessárias para a auto-renovação do tumor. Recentemente, foi demonstrado que a inibição farmacológica do splicing gera neoepítopos imunogênicos derivados do splicing, que são apresentados pelo MHC-I nas células tumorais e induzem uma resposta imune das células T in vivo. Outro potencial alvo terapêutico é a Subunidade 1 do Fator de Splicing 3b (SF3B1), um componente central da maquinaria de splicing que é superexpressa no GBM. Tomados em conjunto, estes resultados apoiam a lógica de estudar os efeitos dos agentes desmetilantes do DNA e dos inibidores de splicing em PDOs e GSCs de glioblastoma para identificar candidatos adequados para desenvolver novas estratégias terapêuticas para esta doença.

As abordagens descritas acima serão aplicadas a pacientes inscritos prospectivamente submetidos à neurocirurgia para glioblastoma. Culturas de neurosfera e PDO serão estabelecidas a partir de tecido tumoral primário. Serão aplicadas triagem de drogas e manipulação celular para induzir a expressão de TE e modular o splicing. Os resultados dos testes in vitro serão correlacionados com o perfil molecular do tumor, resposta aos tratamentos e evolução geral dos pacientes.