Van de patiënt afgeleide organoïden voor geneesmiddelenscreening bij glioblastoom (GlioPDO)

Van patiënten afgeleide organoïden (PDO's) uit chirurgische tumorbiopten zijn een innovatief hulpmiddel om de reactie van individuele patiënten op specifieke therapeutische strategieën te testen. Organoïden zijn driedimensionale (3D) structuren gemaakt van orgaanspecifieke en zelforganiserende cellen die in cultuur kunnen worden gehouden en vermeerderd. Tot nu toe zijn voor een groot aantal soorten kanker BOB's opgesteld, waaronder prostaat-, eierstok- en borstkanker. Er zijn ook Glioblastoma PDO's geproduceerd, en er werd aangetoond dat ze de kenmerken van hun oudertumoren behouden, zowel op mutatieniveau als in termen van genexpressieprofielen en cellulaire heterogeniteit. Omdat ze de kenmerken van de oorspronkelijke tumor beter recapituleren dan GBM-cellijnen, vertegenwoordigen ze een belangrijke vooruitgang voor gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen. Glioblastoma PDO's vertegenwoordigen dus bruikbare preklinische modellen voor het screenen van geneesmiddelen, het testen van CAR-T-cellen en voor het genereren van orthotope xenotransplantaten in de hersenen in modelmodellen . In dit perspectief bieden de PDO's een mogelijkheid om de moleculaire heterogeniteit van glioblastoompatiënten beter te karakteriseren en om nieuwe therapeutische strategieën te testen in een context die de genetische eigenschappen van de oudertumor nabootst.

Immunotherapie komt naar voren als een krachtige aanpak tegen kanker bij sommige soorten kanker. Immunotherapie maakt gebruik van het vermogen van het immuunsysteem om niet-eigen antigenen te herkennen om kankercellen te targeten en te vernietigen. Immuuncontrolepuntremmers (bijv. anti-PD-1 en anti-CTLA-4 monoklonale antilichamen) bleken effectief te zijn bij tumoren die een hoge mutatielast vertonen, zoals melanoom. Helaas heeft glioblastoom een ​​lage mutatielast, wat resulteert in een kleine hoeveelheid neoantigenen. Bovendien is glioblastoom zeer heterogeen, wat betekent dat niet alle patiënten dezelfde antigenen produceren. Er zouden dus grotere voordelen kunnen worden behaald door het ontwikkelen van immuuntherapieën die zich richten op meerdere neoantigenen en door het combineren van neoantigenherkenningsstrategieën met immuuncontrolepuntblokkaderemmers. In dit perspectief kan epigenetische regulatie om de transcriptie van normaal stille transponeerbare elementen (TE's) in glioblastoom door DNA-demethyleringsmiddelen te activeren de productie van neoantigenen verbeteren en een specifieke immuunrespons veroorzaken.

Transcriptie van TE's is laag of afwezig in de meeste volwassen cellen, terwijl het actiever is tijdens de embryonale ontwikkeling, in stamcellen en, intrigerend genoeg, in tumoren. De-repressie van TE's in tumoren vindt plaats door meerdere epigenetische veranderingen in TE-loci, waaronder DNA-demethylering en histon-deacetylering. Beide epigenetische veranderingen kunnen in verband worden gebracht met oncogenese, wat resulteert in verschillende niveaus van epigenetische deregulatie. De overexpressie van TE's in tumoren vergeleken met gezond weefsel heeft geleid tot de zoektocht naar anti-TE T-celreacties bij kanker. Proteogenomische benaderingen hebben tumorspecifieke, niet-canonieke open leesframes (ORF's) geïdentificeerd die coderen voor peptiden die worden gepresenteerd door menselijke leukocytenantigeen (HLA)-I-moleculen op tumorcellen. De meeste van de geïdentificeerde peptiden zijn afgeleid van niet-coderende genomische regio's. Interessant is dat sommige van deze potentiële tumorspecifieke antigenen bij meerdere patiënten worden aangetroffen en in vitro of in muismodellen immuunreacties kunnen veroorzaken. We hebben onlangs een lang niet-coderend RNA (lncRNA) gekarakteriseerd in de antisense-richting van de SOD1-genlocus (SOD1-DT), dat verschillende transponeerbare elementen bevat. Sommige hiervan (LTR en Alu) bevatten ORF's en zouden mogelijk voor verschillende epitopen kunnen coderen. Door in silico-translatie van deze elementen hebben we peptiden geïdentificeerd die overeenkomen met epitopen die al zijn getest als GBM-specifieke doelen voor immuuntherapieën tegen kanker. De DNA-sequentie van deze transponeerbare elementen is echter sterk gemethyleerd in het zenuwweefsel en in de U87 GBM-cellijn (gegevens van Genome Browser). We zullen ons concentreren op de studie van de TE's die tot de LTR12C-familie behoren, omdat is aangetoond dat ze fungeren als versterkerachtige en promotorachtige elementen, waardoor het transcriptomics-landschap op een weefselspecifieke manier vorm krijgt. Er is al aangetoond dat behandelingen met DNMTi en HDACi de expressie van canonieke genen niet veranderen, maar de novo transcriptie van LTR's induceren, die op hun beurt de expressie van specifieke genen aansturen. Naast het produceren van het epitoop is het dus mogelijk om door het activeren van specifieke LTR's de daarmee verbonden genen te activeren. Met name werd LTR12C geïdentificeerd als regulator van proapoptotische genen, zoals TP63 en TNFRSF10B. De voorgestelde strategie zou dus een algemeen toepasbaar middel kunnen zijn om op een gecontroleerde manier proapoptotische genen en immunogene epitopen te produceren, waardoor een zeer specifiek resultaat wordt gegarandeerd.

Een andere potentiële bron van neo-epitopen is een defecte splitsing. Splicing is een fundamentele stap in de rijping van pre-messenger RNA (mRNA) die wordt beheerd door een grote macromoleculaire machinerie, het spliceosoom genaamd. Het spliceosoom verwijdert de introns en ligeert de flankerende exons van de pre-mRNA's, waardoor de volwassen mRNA's ontstaan. Gereguleerde alternatieve splitsing (AS) van veel exons wordt door cellen benut om meerdere eiwitisovormen uit één enkel gen te genereren. Het gewijzigde splitsingsprogramma wordt echter vaak gedereguleerd in kankercellen, waardoor een bruikbare kwetsbaarheid voor tumoren ontstaat, waaronder hersentumoren. Door het profileren van primaire en terugkerende GBM-datasets en niet-kwaadaardige hersenweefseldatasets zijn AS-gebeurtenissen geïdentificeerd die verschillend worden gereguleerd tussen GBM en die kunnen worden vertaald in neo-epitopen. Deze resultaten suggereren dat splicingmodulatie een geldige therapeutische strategie voor glioblastoom zou kunnen vertegenwoordigen. Remming van het argininemethyltransferase PRMT5 in GBM-cellen ontregelt de splitsing en leidt tot verhoogde intronretentie en celveroudering, zowel in vitro als in vivo. Bovendien speelt PRMT5 een rol bij het behoud van GSC's, die nodig zijn voor zelfvernieuwing van de tumor. Onlangs werd aangetoond dat farmacologische remming van splitsing splitsingsgerelateerde immunogene neo-epitopen genereert, die door MHC-I op tumorcellen worden gepresenteerd en in vivo een T-cel-immuunrespons induceren. Een ander potentieel therapeutisch doelwit is de Splicing Factor 3b Subunit 1 (SF3B1), een kerncomponent van de splitsingsmachinerie die tot overexpressie komt in GBM. Alles bij elkaar ondersteunen deze resultaten de grondgedachte van het bestuderen van de effecten van DNA-demethyleringsmiddelen en splicing-remmers bij PDO's en GSC's van glioblastoma om geschikte kandidaten te identificeren om nieuwe therapeutische strategieën voor deze ziekte te ontwikkelen.

De hierboven beschreven benaderingen zullen worden toegepast op prospectief ingeschreven patiënten die neurochirurgie voor glioblastoom ondergaan. Neurosfeerculturen en PDO zullen worden opgebouwd uit primair tumorweefsel. Geneesmiddelscreening en celmanipulatie om TE-expressie te induceren en splicing te moduleren zullen worden toegepast. De resultaten van in vitro tests zullen worden gecorreleerd met het moleculaire profiel van de tumor, de respons op behandelingen en de algehele uitkomst van de patiënt.