喉頭筋におけるsercaの微分発現

この研究では、男性の成人のウィスターラット（清水研究所供給Co.、京都、日本）、8〜12週齢、体重280〜350 g（n = 10）を若いラットとして使用しました。 さらに、年齢24ヶ月のラット（n = 10）が高齢モデルとして採用されました。

動物組織の調製動物は、ペントバルビタールナトリウム（用量30〜60 mg/kg）の腹腔内注射で麻酔をかけ、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む心臓灌流に続いて4％パラホルムアルデヒドで固定しました。 喉頭をすぐに切除し、同じ固定液に約12時間（4°C）浸しました。 組織をパラフィンで処理し、ミクロトーム（厚さ8〜10μm）を使用して切断しました。

研究された内因性喉頭筋肉は、1）内側および外側甲状腺類（MTA、LTA）、（2）外側クリコアリテノイド（LCA）、（3）優れたクリコアリテノイド（SCA）、（4）後部クリコアリーテノイド（PCA）、および（5）でした。 Crichothyroid（CT）。

免疫組織化学（IHC）調査員は、凍結切片で速い繊維タイプの識別に失敗した後、パラフィン切片に移行しました。 脱パラフィン切片をPBS中の3％H2O2と10分間インキュベートした後、マイクロ波処理を続けました（クエン酸バッファー、pH 6で500ワットで5分×3倍）。 次に、一次抗体にインキュベートする前に、切片をブロッキング溶液（0.3 Mグリシン、50 mM塩化アンモニウム、およびPBS中の1％BSA）で30分間インキュベートしました。 切片を抗SERCA1または-SERCA2および抗MHC Iまたは-MHCII（表1）で4℃で1〜2日間インキュベートし、その後洗浄し、AlexaFluor®488ロビー抗マウスIgGおよびFluorとインキュベートしました。 ®594室温で1時間のドンキー抗ヤギIgG二次ABS。 ダブルIHCは、（抗Serca1 +抗Serca2）および（抗Serca2 +抗MHCII）組み合わせを使用して実行して、共発現を確認しました。 二重IHCでは、同じ希釈液を使用した一次または二次抗体の混合で同じステップが行われました。

免疫染色された組織切片は、FV-1000レーザー共焦点顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を使用して検査されました。 ImageJ 1.46ソフトウェアを使用して、各抗体の陽性細胞の割合を手動でカウントおよび計算しました。

8〜12週間の老化したラットでの除神経ラットの免疫組織化学、喉頭は、ペントバルビタールを伴う麻酔下で標準的な動作顕微鏡を使用した正中線切開を介してアプローチされました。 右の再発性および上喉頭神経を特定した後、右の再発性喉頭神経から1 cmのセグメントを除去し、両端を結紮しました。 右上の喉頭神経も分割されました。 除神経されたラット群は、2、4、8、および12週間後に犠牲にされました。 喉頭を収集し、上記と同じ手順を使用してIHCのために準備しました（各グループでn = 5）。

マルチカラーファイバータイピングを使用したMHCサブタイプ：

調査の開始時に、冷凍セクションを試しました。 自己蛍光とバックグラウンドノイズを減らすためのいくつかの技術の試験の後、調査員は良好な染色を行うことができませんでした。 その後、調査員はMHCのサブタイピングを中止し、パラフィン包埋ブロック統計分析に移行しました。各筋肉の相対SERCAおよびMHC組成を計算しました。 各ラット抗体の正の細胞率の利用可能なデータは、SPSS統計ソフトウェアバージョン16を使用して統計的に分析されました。 統計的比較は、対応のない2尾の生徒のt検定を使用して実行され、P <0.05で有意と見なされました。

一元配置分散分析（ANOVA）に続いて、シェフの事後試験が実行され、除神経中の各筋肉のMHCとSERCA組成を対側側と年齢との若いと比較しました。 提示された値は、平均値±SD（標準偏差）であり、SDはラットを越えています。