Differential SERCA -ekspression i laryngeale muskler

Dyr i denne undersøgelse, mandlige voksne Wistar-rotter (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japan), 8-12 ugers alder, der vejer 280-350 g (n = 10) blev brugt som unge rotter. Derudover blev 24 måneder gamle rotter (n = 10) anvendt som alderen modeller.

Dyrevævsforberedelsesdyr blev bedøvet med en intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (dosis 30-60 mg/kg) og blev fikseret med 4% paraformaldehyd efter hjerteperfusion med 0,01 m phosphatbufferet saltvand (PBS). Laryngerne blev straks udskåret og nedsænket i det samme fikseringsmiddel i cirka 12 timer ved (4 ° C). Væv blev behandlet i paraffin og sektioneret under anvendelse af et mikrotom (8-10 μm tykkelse).

De studerede iboende laryngeale muskler var: 1) mediale og laterale thyroaryenoid (MTA, LTA), (2) lateral cricoaryenoidoidoidoid (LCA), (3) overlegen cricoaryenoid (SCA), (4) posterior cricoaryenoid (PCA) og (5) Cricothyroid (CT).

Immunohistokemi (IHC) Efterforskerne stod overfor mislykket identifikation af hurtig fibertype på frosne sektioner, skiftede vi til paraffinsektioner. Deparaffiniserede sektioner blev inkuberet med 3% H2O2 i PBS i 10 minutter efterfulgt af mikrobølgebehandling (5 minutter × 3 gange ved 500 watt i citratbuffer, pH 6). Derefter blev sektioner inkuberet i en blokerende opløsning (0,3 m glycin, 50 mM ammoniumchlorid og 1% BSA i PBS) i 30 minutter før inkubation i primære antistoffer. Sektioner blev inkuberet med anti-serca1 eller -serca2 og anti-MHC I eller -MHCII (tabel 1) antistoffer i 1-2 dage ved 4 ◦C, derefter vasket og inkuberet med Alexa Fluor® 488 æsel Anti-mus IgG og Fluor ® 594 æsel Anti-gede IgG Sekundær ABS i 1 time ved stuetemperatur. Dobbelt IHC blev udført under anvendelse af (anti-serca1 + anti-serca2) og (anti-serca2 + anti-MHCII) kombinationer for at kontrollere co-ekspression. I dobbelt IHC blev de samme trin udført med en blanding af primære eller sekundære antistoffer med de samme fortyndinger.

Immunfarvede vævsektioner blev undersøgt under anvendelse af et FV-1000-laserkonfokalt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). ImageJ 1.46 -software blev brugt til manuelt at tælle og beregne procentdelen af ​​positive celler for hvert antistof.

Immunohistokemi for denerveret rotte i 8-12 uger, alderen rotter, blev strubehovedet nærmet sig gennem et midtlinjesnit under anvendelse af et standard driftsmikroskop under anæstesi med natriumpentobarbital. Efter identifikation af de rigtige tilbagevendende og overlegne laryngeale nerver blev et 1 cm segment fjernet fra den rigtige tilbagevendende laryngeal nerve, og begge ender blev ligeret. Den rigtige overlegne laryngeale nerve blev også delt. De denervaterede rottegrupper blev ofret efter 2, 4, 8 og 12 uger. Larynxen blev opsamlet og forberedt til IHC under anvendelse af den samme procedure beskrevet ovenfor (n = 5 i hver gruppe).

MHC-undertyper ved hjælp af flerfarvetypning:

I begyndelsen af ​​vores forskning prøvede vi det frosne afsnit. Efter forsøg med flere teknikker til at reducere autofluorescens og baggrundsstøj kunne efterforskerne ikke have god farvning. Derefter afbrød efterforskerne MHC-undertyping og skiftede til paraffinindlejrede blokke Statistisk analyse Den relative SERCA og MHC-sammensætning for hver muskel blev beregnet. De tilgængelige data for den positive celleprocent af hvert rotte -antistof blev statistisk analyseret ved anvendelse af SPSS Statistical Software, version 16. Statistiske sammenligninger blev udført under anvendelse af den uparrede to-halede studerendes t-test og blev betragtet som signifikant ved P <0,05.

Envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Scheffes post hoc-test blev udført for at sammenligne MHC- og SERCA-sammensætningen for hver muskel i denervation med den kontralaterale side og unge med alderen. De præsenterede værdier er middel ± SD (standardafvigelse), hvor SD er på tværs af rotter.