Expresión diferencial de SERCA en músculos laríngeos

Animales En este estudio, ratas wistar adultas machos (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kioto, Japón), 8-12 semanas de edad, que pesaba 280-350 g (n = 10) se usaron como ratas jóvenes. Además, se emplearon ratas de 24 meses (n = 10) como modelos envejecidos.

Los animales de preparación del tejido animal se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio (dosis de 30-60 mg/kg) y se fijaron con paraformaldehído al 4% después de la perfusión cardíaca con solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (PBS). Las larynges se extirparon inmediatamente y se sumergieron en el mismo fijador durante aproximadamente 12 horas a (4 ° C). Los tejidos se procesaron en parafina y se seccionaron usando un microtomo (8-10 μm de espesor).

Los músculos laríngeos intrínsecos estudiados fueron: 1) tiroararytenoides mediales y laterales (MTA, LTA), (2) cricoararytenoide lateral (LCA), (3) cricoararinghenoides superiores (SCA), (4) cricoararyhenoide posterior (PCA) y (5) Cricothyroid (CT).

Inmunohistoquímica (IHC) Los investigadores enfrentaron una identificación de tipo de fibra rápida sin éxito en secciones congeladas y luego cambiamos a secciones de parafina. Las secciones desparafinizadas se incubaron con H2O2 al 3% en PBS durante 10 minutos seguido de tratamiento con microondas (5 minutos × 3 veces a 500 vatios en tampón de citrato, pH 6). Luego, las secciones se incubaron en una solución de bloqueo (glicina 0.3 M, cloruro de amonio 50 mM y 1% BSA en PBS) durante 30 minutos antes de la incubación en anticuerpos primarios. Las secciones se incubaron con anticuerpos anti-SERCA1 o -SERCA2 y anti-MHC I o -HCII (Tabla 1) durante 1-2 días a 4 ° C, luego se lavaron, y se incubaron con Alexa Fluor® 488 Donkey Anti-Mouse IgG y Fluor ® 594 ABS secundarios de IgG anti-goat de burro durante 1 hora a temperatura ambiente. Doble IHC se realizó utilizando combinaciones (anti-SERCA1 + anti-SERCA2) y (anti-MHCII) (anti-MHCII) para verificar la coexpresión. En el doble IHC, se realizaron los mismos pasos con una mezcla de anticuerpos primarios o secundarios con las mismas diluciones.

Se examinaron secciones de tejido inmunoderado utilizando un microscopio confocal láser FV-1000 (Olympus, Tokio, Japón). El software ImageJ 1.46 se usó para contar y calcular manualmente el porcentaje de células positivas para cada anticuerpo.

Inmunohistoquímica para ratas denervadas En 8-12 semanas, ratas envejecidas, la laringe se abordó a través de una incisión de la línea media utilizando un microscopio operativo estándar bajo anestesia con pentobarbital de sodio. Después de la identificación de los nervios laríngeos recurrentes y superiores derecho, se retiró un segmento de 1 cm del nervio laríngeo recurrente derecho y ambos extremos se ligaron. El nervio laríngeo superior derecho también se dividió. Los grupos de ratas denervados fueron sacrificados después de 2, 4, 8 y 12 semanas. La laringe se recogió y se preparó para IHC utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente (n = 5 en cada grupo).

Subtipos de MHC utilizando la tipificación de fibra multicolor:

Al comienzo de nuestra investigación, probamos la sección congelada. Después de las pruebas de varias técnicas para disminuir la autofluorescencia y el ruido de fondo, los investigadores no tuvieron buenas manchas. Luego, los investigadores descontinuaron el subtipo de MHC y se desplazaron a análisis estadísticos de bloques embebidos en parafina, se calculó la composición relativa de SERCA y MHC para cada músculo. Los datos disponibles para el porcentaje celular positivo de cada anticuerpo de rata se analizaron estadísticamente utilizando el software estadístico SPSS, versión 16. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba t de Student de dos colas no apareada y se consideraron significativos en P <0.05.

El análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Scheffe se realizó para comparar la composición de MHC y SERCA para cada músculo en la denervación con el lado contralateral y los jóvenes con la edad. Los valores presentados son medias ± DE (desviación estándar), con SD a través de ratas.