Diferenciální exprese SERCA ve svalech hrtanu

Zvířata v této studii byly jako mladé krysy použity mužské dospělé krysy (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japonsko), 8-12 týdnů, vážící 280-350 g (n = 10). Kromě toho byly jako starší modely použity 24měsíční krysy (n = 10).

Zvířata přípravy na zvířata byla anestetizována intraperitoneální injekcí pentobarbitalu sodného (dávka 30-60 mg/kg) a byla fixována 4% paraformaldehydem po srdeční perfuzi 0,01 m solným roztokem (PBS). Hrotky byly okamžitě vyříznuty a ponořeny do stejného fixativa po dobu přibližně 12 hodin při (4 ° C). Tkáně byly zpracovány v parafinu a rozděleny pomocí mikrotomu (tloušťka 8-10 μm).

Studované vnitřní hrtanové svaly byly: 1) mediální a laterální tyroarytenoid (MTA, LTA), (2) laterální cricoarytenoid (LCA), (3) vynikající cricoarytenoid (SCA), (4) zadní crikoarytenoid (PCA) a (5) Cricothyroid (CT).

Imunohistochemie (IHC) Vyšetřovatelé čelili neúspěšné identifikaci typu vlákna na zmrazených řezech, pak jsme se přesunuli do parafinových řezů. Deparafinizované řezy byly inkubovány s 3% H2O2 v PBS po dobu 10 minut a následovala ošetření mikrovlnnou troubou (5 minut × 3krát při 500 Watt v citrátové pufru, pH 6). Poté byly řezy inkubovány v blokovacím roztoku (0,3 M glycinu, 50 mM chloridu amonného a 1% BSA v PBS) po dobu 30 minut před inkubací v primárních protilátkách. Řezy byly inkubovány s anti-SERCA1 nebo -Serca2 a Anti-MHC I nebo -MHCII (tabulka 1) protilátky po dobu 1-2 dnů při 4 ° C, poté promyty a inkubovány s Alexa Fluor® 488 Donkey Anti-Mouse IgG a Fluor a Fluor ® 594 Oskey Anti-Goat IgG sekundární abs po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Dvojitý IHC byl proveden za použití kombinací (anti-SERCA1 + Anti-SERCA2) a (Anti-SERCA2 + Anti-MHCII) pro kontrolu koexprese. Ve dvojitém IHC byly stejné kroky provedeny se směsí primárních nebo sekundárních protilátek se stejným ředěním.

Imunostaitované tkáňové řezy byly zkoumány pomocí laserového konfokálního mikroskopu FV-1000 (Olympus, Tokio, Japonsko). Software ImageJ 1.46 byl použit k ručnímu počítání a výpočtu procenta pozitivních buněk pro každou protilátku.

Imunohistochemie pro denervovanou krysu za 8-12 týdnů, ve věku potkanů, byl hrtan přistupován pomocí řezu střední linie pomocí standardního operačního mikroskopu pod anestézií s pentobarbitalem sodným. Po identifikaci pravého recidivujícího a vynikajícího hrtanového nervů byl z pravého opakujícího se hrtanového nervu odstraněn 1 cm segment a oba konce byly ligovány. Rovněž byl rozdělen také pravý nadřazený hrtanový nerv. Denervované skupiny potkanů ​​byly obětovány po 2, 4, 8 a 12 týdnech. Hrtan byl shromážděn a připraven pro IHC pomocí stejného postupu popsaného výše (n = 5 v každé skupině).

MHC podtypy pomocí vícebarevného psaní vlákna:

Na začátku našeho výzkumu jsme vyzkoušeli zmrazenou sekci. Po zkouškách několika technik ke snížení autofluorescence a šumu na pozadí se vyšetřovatelé nedokázali dobré barvení. Poté vyšetřovatelé ukončili MHC subtypování a přesunuli se do parafínových bloků statistických analýzy Relativní složení SERCA a MHC pro každý svaly. Dostupné údaje o pozitivním procentu buněk každé potkaní protilátky byly statisticky analyzovány pomocí statistického softwaru SPSS, verze 16. Statistická srovnání byla prováděna pomocí nepárového dvoustranného Studentova t-testu a byla považována za významné při p <0,05.

Byla provedena jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) následovaná Scheffeův post hoc test, aby se porovnal složení MHC a SERCA pro každý sval v denervaci s kontralaterální stranou a mladý s věkem. Prezentované hodnoty jsou průměry ± SD (standardní odchylka), přičemž SD je napříč krysy.