Serca -differentiaalinen ekspressio kurkunpään lihaksissa

Tämän tutkimuksen eläimiä aikuisten Wistar-rotat (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japani), 8-12 viikon ikäisiä, painoi 280-350 g (n = 10) nuorina rotilla. Lisäksi ikääntyneinä malleina käytettiin 24 kuukauden ikäisiä rottia (n = 10).

Eläinkudoksen valmistuseläimet nukutettiin natriumpentobarbitaalin (annos 30-60 mg/kg) intraperitoneaalisella injektiolla ja kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä sydämen perfuusion jälkeen 0,01 M fosfaattipuskuriin (PBS) (PBS) kanssa. Kurahat leikattiin välittömästi ja upotettiin samaan kiinnitykseen noin 12 tunnin ajan (4 ° C). Kudokset prosessoitiin parafiinissa ja leikattiin käyttämällä mikrotomia (paksuus 8-10 μm).

Tutkitut luontaiset kurkunpään lihakset olivat: 1) mediaaliset ja lateraaliset tyroarytenoidit (MTA, LTA), (2) lateraalinen krikoytenoidi (LCA), (3) ylivoimainen krikoytenoidi (SCA), (4) takaosan krikoonoidi (PCA) ja (5) Cricothyroid (CT).

Immunohistokemia (IHC) Tutkijat kohtasivat epäonnistuneen nopean kuitutyypin tunnistamisen jäädytetyissä osissa, sitten siirryimme parafiiniosiin. Deparafinoituja leikkeitä inkuboitiin 3% H2O2: n kanssa PBS: ssä 10 minuutin ajan, mitä seurasi mikroaaltokahoitus (5 minuuttia x 3 kertaa 500 wattia sitraattipuskurissa, pH 6). Sitten leikkeitä inkuboitiin estoliuoksessa (0,3 M glysiini, 50 mM ammoniumkloridi ja 1% BSA PBS: ssä) 30 minuutin ajan ennen inkubointia primaarisissa vasta -aineissa. Leikkeitä inkuboitiin anti-SERCA1- tai -SERCA2- ja anti-MHC I: n tai -MHCII: n kanssa (taulukko 1) Vasta-aineiden kanssa 1-2 päivän ajan 4 ° C: ssa, pestiin ja inkuboitiin Alexa Fluor® 488 Donkey Anti-Mouse IgG: n ja Fluorin kanssa ® 594 Aasien anti-Goat IgG: n sekundaarinen ABS yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Double IHC suoritettiin käyttämällä (anti-SERCA1 + anti-SERCA2) ja (anti-SERCA2 + anti-MHCII) -yhdistelmiä yhteisyeksyn tarkistamiseksi. Kaksinkertaisesti IHC: ssä samat vaiheet tehtiin primaaristen tai sekundaaristen vasta -aineiden seoksella samoilla laimennuksilla.

Immunoväämättömät kudosleikkeet tutkittiin käyttämällä FV-1000-laserkonfokaalimikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani). ImageJ 1.46 -ohjelmistoa käytettiin laskemaan manuaalisesti ja laskemaan positiivisten solujen prosenttiosuus kullekin vasta -aineelle.

Immunohistokemia denervoidulle rotalle 8-12 viikossa, ikääntyneissä rotissa, kurkunpään lähestyttiin keskiviivan viillon kautta käyttämällä anestesian vakiona olevaa mikroskooppia natriumpentobarbitaalilla. Kun oikeat toistuvat ja ylivoimaiset kurkunpään hermot tunnistettiin, 1 cm: n segmentti poistettiin oikeasta toistuvasta kurkunpään hermosta ja molemmat päät ligoitiin. Myös oikea ylivoimainen kurkunpään hermo jaettiin. Denervoidut rottaryhmät uhrattiin 2, 4, 8 ja 12 viikon kuluttua. Kurkunpään kerättiin ja valmistettiin IHC: lle käyttämällä samaa edellä kuvattua menettelyä (n = 5 kussakin ryhmässä).

MHC-alatyypit käyttämällä monivärisiä kuitutyyppiä:

Tutkimuksemme alussa kokeilimme jäädytettyä osaa. Useiden tekniikoiden kokeiden jälkeen autofluoresenssin ja taustamelun vähentämiseksi tutkijoilla ei ollut hyvää värjäystä. Sitten tutkijat lopettivat MHC-alatyyppin ja siirtyivät parafiiniin upotettuihin lohkoihin tilastollinen analyysi Kummankin lihaksen suhteellinen SERCA- ja MHC-koostumus. Kunkin rotan vasta -aineen positiivisen soluprosentin käytettävissä olevat tiedot analysoitiin tilastollisesti käyttämällä SPSS -tilastollista ohjelmistoa, versio 16. Tilastolliset vertailut suoritettiin käyttämällä parittomia kaksisuuntaisia ​​opiskelijoiden t-testiä ja niitä pidettiin merkitsevänä p <0,05.

Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Scheffe's Post Hoc -testi, suoritettiin MHC: n ja SERCA-koostumuksen vertaamiseksi jokaiselle denerentoitulle lihakselle kontralateraalisen puolen kanssa ja nuorena iän kanssa. Esitetyt arvot ovat keskiarvot ± SD (keskihajonta), SD: n ollessa rottien yli.