Differensiell serca -uttrykk i laryngeale muskler

Dyr i denne studien ble mannlige voksne Wistar-rotter (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japan), 8-12 ukers alder, og veide 280-350 g (n = 10) brukt som unge rotter. I tillegg ble 24 måneder gamle rotter (n = 10) brukt som alderen modeller.

Dyr til dyrevev ble bedøvd med en intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbital (dose 30-60 mg/kg) og ble fikset med 4% paraformaldehyd etter hjerteperfusjon med 0,01 m fosfatbuffert saltvann (PBS). Laryntene ble skåret ut umiddelbart og nedsenket i samme fikseringsmiddel i omtrent 12 timer ved (4 ° C). Vev ble behandlet i parafin og seksjonert ved bruk av et mikrotom (8-10 μm tykkelse).

De iboende laryngeale musklene som ble undersøkt var: 1) medial og lateral skjæranytenoid (MTA, LTA), (2) lateral cricoarytenoid (LCA), (3) Superior cricoarytenoid (SCA), (4) Posterior cricoarytenoid (PCA) og (5) Cricothyroid (CT).

Immunohistochemistry (IHC) Etterforskerne sto overfor mislykket fast fibertype identifikasjon på frosne seksjoner, så skiftet vi til parafinseksjoner. Deparaffiniserte seksjoner ble inkubert med 3% H2O2 i PBS i 10 minutter etterfulgt av mikrobølgebehandling (5 minutter × 3 ganger ved 500 watt i sitratbuffer, pH 6). Deretter ble seksjoner inkubert i en blokkeringsløsning (0,3 M glycin, 50 mM ammoniumklorid og 1% BSA i PBS) i 30 minutter før inkubasjon i primære antistoffer. Seksjoner ble inkubert med anti-SERCA1 eller -Serca2 og anti-MHC I eller -MHCII (tabell 1) antistoffer i 1-2 dager ved 4 ◦C, deretter vasket og inkubert med Alexa Fluor® 488 Donkey Anti-Mouse IgG og Fluor ® 594 Donkey Anti-Goat IgG Secondary ABS i 1 time ved romtemperatur. Dobbelt IHC ble utført ved bruk av (anti-SERCA1 + anti-SERCA2) og (anti-SERCA2 + anti-MHCII) kombinasjoner for å sjekke samekspresjon. I dobbelt IHC ble de samme trinnene gjort med en blanding av primære eller sekundære antistoffer med de samme fortynningene.

Immunfargede vevsseksjoner ble undersøkt ved bruk av et FV-1000 laserkonfokalt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). ImageJ 1.46 -programvare ble brukt til å telle manuelt og beregne prosentandelen av positive celler for hvert antistoff.

Immunohistokjemi for denerverte rotte i 8-12 uker, alderen rotter, ble strupehodet kontaktet gjennom et midtlinje snitt ved bruk av et standard driftsmikroskop under anestesi med natrium pentobarbital. Etter identifisering av riktig tilbakevendende og overlegen laryngeale nerver, ble et 1 cm segment fjernet fra høyre tilbakevendende laryngeal nerve og begge ender ble ligert. Høyre overordnede laryngeal nerve ble også delt. De denerverte rottegruppene ble ofret etter 2, 4, 8 og 12 uker. Strupehodet ble samlet og utarbeidet for IHC ved å bruke den samme prosedyren beskrevet ovenfor (n = 5 i hver gruppe).

MHC undertyper ved bruk av flerfargede fibertyping:

I begynnelsen av forskningen vår prøvde vi den frosne delen. Etter forsøk på flere teknikker for å redusere autofluorescens og bakgrunnsstøy, klarte ikke etterforskerne å ha god flekker. Deretter avsluttet etterforskerne MHC-undertyping og skiftet til parafin-innebygde blokkeringsstatistisk analyse Den relative SERCA- og MHC-sammensetningen for hver muskel ble beregnet. De tilgjengelige dataene for den positive celleprosenten av hvert rotteantistoff ble statistisk analysert ved bruk av SPSS statistisk programvare, versjon 16. Statistiske sammenligninger ble utført ved bruk av den uparede to-tailed Students t-test og ble ansett som signifikante ved p <0,05.

Enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Scheffes post hoc-test ble utført for å sammenligne MHC- og SERCA-sammensetningen for hver muskel i denervering med den kontralaterale siden og ung med alderen. Verdier presentert er midler ± SD (standardavvik), med SD som er på tvers av rotter.