Дифференциальная экспрессия SERCA в мышцах гортани

Животные в этом исследовании, мужские крысы Вистар Вистар (Shimizu Laboratory Supplies Co., Киото, Япония), возраст 8-12 недель, весом 280-350 г (n = 10) использовали в качестве молодых крыс. Кроме того, 24-месячные крысы (n = 10) использовались в качестве старых моделей.

Животные животных животных животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (доза 30-60 мг/кг) и фиксировали 4% параформальдегидом после перфузии сердца 0,01 М фосфатного бухря солевого раствора (PBS). Ошнуты были немедленно вырезаны и погружали в тот же фиксатор в течение приблизительно 12 часов при (4 ° C). Ткани обрабатывали в парафине и срезали с использованием микротома (толщины 8-10 мкм).

The intrinsic laryngeal muscles studied were: 1) medial and lateral thyroarytenoid (MTA, LTA), (2) lateral cricoarytenoid (LCA), (3) Superior cricoarytenoid (SCA), (4) posterior cricoarytenoid (PCA), and (5) CRICOTHYROIR (CT).

Иммуногистохимия (IHC) Следователи столкнулись с безуспешной идентификацией быстрого волокна на замороженных секциях, затем мы перешли на парафиновые секции. ДеПрафинизированные срезы инкубировали с 3% H2O2 в PBS в течение 10 минут, а затем микроволновую обработку (5 минут × 3 раза при 500 Вт в цитратном буфере, pH 6). Затем срезы инкубировали в блокирующем растворе (0,3 М глицин, 50 мМ хлорида аммония и 1% BSA в PBS) в течение 30 минут до инкубации в первичных антителах. Срезы инкубировали с антителами против Serca1 или -Serca2 и анти-Mhc i или -mhcii (таблица 1) в течение 1-2 дней при 4 ° C, затем промывали и инкубировали с Alexa Fluor® 488 Anti-Mouse IgG и флюор. ® 594 Осел Анти-Коротский IgG Вторичный ABS в течение 1 часа при комнатной температуре. Двойной IHC проводили с использованием комбинаций (Anti-Serca1 + Anti-Serca2) и (анти-serca2 + anti-mhcii) для проверки совместной экспрессии. В двойном IHC те же шаги были сделаны со смесью первичных или вторичных антител с теми же разведениями.

Иммуноокрашенные срезы ткани были исследованы с использованием лазерного конфокального микроскопа FV-1000 (Olympus, Токио, Япония). Программное обеспечение ImageJ 1.46 использовалось для вручную и расчета процента положительных клеток для каждого антитела.

Иммуногистохимия для денервированной крысы За 8-12 недель, выдержанных крыс, гортань подходила через средний разрез с использованием стандартного рабочего микроскопа под анестезией с пентобарбиталом натрия. После идентификации правых рецидивирующих и верхних гортажных нервов, сегмент 1 см был удален из правого рецидивирующего гортатного нерва, и оба конца лигировали. Правый верхний нерв гортани также был разделен. Денервенные группы крыс жертвуют после 2, 4, 8 и 12 недель. Гортань собирали и готовили для IHC с использованием той же процедуры, описанной выше (n = 5 в каждой группе).

Подтипы MHC с использованием разноцветного волокнового типирования:

В начале нашего исследования мы попробовали замороженный раздел. После испытаний нескольких методов для уменьшения автофлуоресценции и фонового шума, следователи не смогли иметь хорошее окрашивание. Затем исследователи прекратили подтинг MHC и перенеслись на парафиновый блоки, статистический анализ был рассчитан относительный состав SERCA и MHC для каждой мышцы. Доступные данные для положительного процента клеток каждого антитела крыс были статистически проанализированы с использованием статистического программного обеспечения SPSS, версия 16. Статистические сравнения были выполнены с использованием непарного двухстороннего T-критерия студента и считались значимыми при P <0,05.

Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA), за которым следовал, был проведен последующий тест Шеффе для сравнения композиции MHC и SERCA для каждой мышцы в денервации с контралатеральной стороной и молодым с возрастом. Представленные значения представляют собой средние значения ± SD (стандартное отклонение), причем SD находится на крысах.