후두 근육에서의 차등 SERCA 발현

이 연구에서,이 연구에서, 수컷 성인 Wistar 쥐 (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japan), 8-12 주령, 무게는 280-350 g (n = 10)을 어린 쥐로 사용 하였다. 또한, 24 개월 된 래트 (n = 10)는 노화 된 모델로 사용되었다.

동물 조직 제조 동물을 펜 토 바르 비탈 나트륨 (복용량 30-60 mg/kg)의 복강 내 주사로 마취시키고 0.01 M 인산염-완충 식염수 (PBS)로 심장 관류 후 4% 파라 포름 알데히드로 고정시켰다. 후두를 즉시 절제하고 (4 ℃)에서 약 12 ​​시간 동안 동일한 고정 장치에 담았다. 조직을 파라핀으로 가공하고 마이크로톰 (8-10 μm 두께)을 사용하여 절단시켰다.

연구 된 본질적인 후두 근육은 1) 내측 및 측면 갑상선 텐 노이드 (MTA, LTA), (2) 측면 크리코 아레 텐이 노이드 (LCA), (3) 우수한 크리코 아레 텐이드 (SCA), (4) 후부 크리코 아레 텐이드 (PCA) 및 (5)였다. 미세 점화 (CT).

면역 조직 화학 (IHC) 연구자들은 냉동 섹션에서 실패한 빠른 섬유 유형 식별에 직면 한 후 파라핀 섹션으로 이동했습니다. 탈 파라핀 화 된 섹션을 PBS 중 3% H2O2와 10 분 동안 인큐베이션 한 후 전자 레인지 처리 (시트 레이트 완충액에서 500 와트에서 5 분 x 3 회)를 배양 하였다. 이어서, 1 차 항체에서 배양하기 전에 30 분 동안 차단 용액 (0.3m 글리신, 50mM 염화 암모늄 및 1% BSA)에서 섹션을 인큐베이션 하였다. 섹션을 항 -Serca1 또는 -serca2 및 항 -MHC I 또는 -MHCII (표 1) 4 ℃에서 1-2 일 동안 항체와 함께 인큐베이션 한 다음 세척 한 다음 Alexa Fluor® 488 당나귀 항-마우스 IgG 및 Fluor와 함께 인큐베이션 하였다. 실온에서 1 시간 동안 ® 594 당나귀 항-염소 IgG 2 차 ABS. 이중 IHC는 (항 -Serca1 + 항 -Serca2) 및 (항 ​​-SercA2 + 항 -MHCII) 조합을 사용하여 공동 발현을 확인 하였다. 이중 IHC에서, 동일한 단계는 동일한 희석제와 1 차 또는 2 차 항체의 혼합물로 수행되었다.

면역 염색 된 조직 섹션을 FV-1000 레이저 공 초점 현미경 (일본 도쿄 올림푸스)을 사용하여 검사 하였다. ImageJ 1.46 소프트웨어를 사용하여 각 항체에 대한 양성 세포의 백분율을 수동으로 계산하고 계산했습니다.

8-12 주 동안, 노화 된 래트, 나트륨 펜토 바르 비탈로 마취 하의 표준 작동 현미경을 사용하여 중간 선 절개를 통해 후두에 접근 하였다. 올바른 재발 및 우수한 후두 신경의 확인 후, 오른쪽 재발 성 후두 신경에서 1cm 세그먼트를 제거하고 양쪽 끝이 결찰되었다. 올바른 우수한 후두 신경도 나뉘어졌다. 방해받은 쥐 그룹은 2, 4, 8 및 12 주 후에 희생되었다. 후두를 수집하고 위에서 설명한 동일한 절차를 사용하여 IHC를 위해 준비 하였다 (각 그룹에서 n = 5).

멀티 컬러 파이버 타이핑을 사용한 MHC 하위 유형 :

연구가 시작될 때 우리는 냉동 섹션을 시도했습니다. 자가 형광 및 배경 노이즈를 감소시키기위한 여러 기술의 시험 후, 연구자들은 우수한 염색을 가하지 못했습니다. 그런 다음, 연구자들은 MHC 하위 유형을 중단하고 파라핀-매립 블록 통계 분석으로 이동시켰다. 각 래트 항체의 양성 세포 백분율에 대한 이용 가능한 데이터를 SPSS 통계 소프트웨어 버전 16을 사용하여 통계적으로 분석 하였다. 통계적 비교는 짝을 이루지 않은 양측 학생의 t- 검정을 사용하여 수행되었으며 p <0.05에서 유의 한 것으로 간주되었다.

일방적 인 분산 분석 (ANOVA)에 이어 Scheffe의 사후 검사를 수행하여 대측 측면에서 각 근육에 대한 MHC 및 SERCA 조성물을 반대쪽 측면과 나이가 들어감에 따라 젊게 비교했습니다. 제시된 값은 평균 ± SD (표준 편차)이며 SD는 쥐를 가로 질러 있습니다.