Expressão diferencial de serca nos músculos da laringe

Os animais deste estudo, ratos Wistar adultos masculinos (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japão), 8 a 12 semanas de idade, pesando 280-350 g (n = 10), foram usados ​​como ratos jovens. Além disso, ratos de 24 meses (n = 10) foram empregados como modelos envelhecidos.

Os animais de preparação do tecido animal foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (dose 30-60 mg/kg) e foram fixados com paraformaldeído a 4% após perfusão cardíaca com salina tamponada com fosfato de 0,01 M (PBS). As laringe foram excisadas imediatamente e imersas no mesmo fixador por aproximadamente 12 horas a (4 ° C). Os tecidos foram processados ​​em parafina e seccionados usando um microtome (8-10 μm de espessura).

Os músculos laringeis intrínsecos estudados foram: 1) tireoilóides medial e lateral (MTA, LTA), (2) cricoartenóide lateral (LCA), (3) cricoartenóide superior (SCA), (4) criceoartenóide posterior (PCA) e (5) CRICOTIOid (CT).

Imuno -histoquímica (IHC) Os investigadores enfrentaram identificação do tipo de fibra rápida sem sucesso em seções congeladas e depois mudamos para seções de parafina. As seções desparafinizadas foram incubadas com H2O2 a 3% em PBS por 10 minutos, seguidos pelo tratamento com microondas (5 minutos × 3 vezes a 500 watts em tampão de citrato, pH 6). Em seguida, as seções foram incubadas em uma solução de bloqueio (glicina 0,3 m, cloreto de amônio 50 mM e BSA a 1% em PBS) por 30 minutos antes da incubação em anticorpos primários. As seções foram incubadas com anticorpos anti-sercA1 ou -Serca2 e anti-MHC I ou -MHCII (Tabela 1) por 1-2 dias a 4 ° C, depois lavados e incubados com Alexa Fluor® 488 Donkey Anti-mouse IgG e Fluor ® 594 Donkey Anti-GOAT IgG Secundário ABS por 1 hora à temperatura ambiente. O IHC duplo foi realizado usando combinações (anti-sercA1 + anti-sercA2) e (anti-sercA2 + anti-MHCII) para verificar a co-expressão. No Double IHC, as mesmas etapas foram feitas com uma mistura de anticorpos primários ou secundários com as mesmas diluições.

As seções de tecido imunocoradas foram examinadas usando um microscópio confocal a laser FV-1000 (Olympus, Tóquio, Japão). O software ImageJ 1.46 foi usado para contar manualmente e calcular a porcentagem de células positivas para cada anticorpo.

Imuno-histoquímica para rato desnervado Em 8 a 12 semanas, ratos idosos, a laringe foi abordada através de uma incisão na linha média usando um microscópio operacional padrão sob anestesia com pentobarbital de sódio. Após a identificação dos nervos laringeais recorrentes e superiores corretos, um segmento de 1 cm foi removido do nervo laríngeo recorrente direito e as duas extremidades foram ligadas. O nervo laríngeo superior direito também foi dividido. Os grupos desnervados de ratos foram sacrificados após 2, 4, 8 e 12 semanas. A laringe foi coletada e preparada para IHC usando o mesmo procedimento descrito acima (n = 5 em cada grupo).

Subtipos MHC usando digitação de fibra multicolorida:

No início de nossa pesquisa, tentamos a seção congelada. Após ensaios de várias técnicas para diminuir a autofluorescência e o ruído de fundo, os pesquisadores não tiveram boa coloração. Em seguida, os investigadores interromperam a subtipagem do MHC e mudaram para os blocos estatísticos embebidos em parafina, a composição relativa de SERCA e MHC para cada músculo foi calculada. Os dados disponíveis para a porcentagem celular positiva de cada anticorpo de rato foram analisados ​​estatisticamente usando o software estatístico SPSS, versão 16. As comparações estatísticas foram realizadas usando o teste t de Student de dois caudas não pareadas e foram consideradas significativas em p <0,05.

A análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Scheffe foi realizada para comparar a composição MHC e SERCA para cada músculo em desnervação com o lado contralateral e jovem com a idade. Os valores apresentados são médias ± DP (desvio padrão), com SD sendo entre ratos.