Expression différentielle de la serque dans les muscles laryngés

Les animaux de cette étude, les rats Wistar adultes mâles (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japon), 8-12 semaines, pesant 280 à 350 g (n = 10) ont été utilisés comme jeunes rats. De plus, des rats de 24 mois (n = 10) ont été utilisés comme modèles âgés.

Les animaux de préparation des tissus animaux ont été anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium (dose de 30 à 60 mg / kg) et ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4% après une perfusion cardiaque avec un solution saline tamponnée au phosphate de 0,01 M (PBS). Les larynges ont été excisés immédiatement et immergés dans le même fixateur pendant environ 12 heures à (4 ° C). Les tissus ont été traités en paraffine et sectionnés à l'aide d'un microtome (8-10 μm d'épaisseur).

Les muscles laryngés intrinsèques étudiés étaient: 1) le thyroaryténoïde médial et latéral (MTA, LTA), (2) le cricoaryténoïde latéral (LCA), (3) le cricoaryténoïde supérieur (SCA), (4) le cricoararyténoïde postérieur (PCA) et (5) Cricothyroid (CT).

Immunohistochimie (IHC) Les enquêteurs ont été confrontés à l'identification infructueuse de type fibre rapide sur des sections congelées, puis nous nous sommes déplacés vers des sections de paraffine. Les coupes déparaffinées ont été incubées avec 3% de H2O2 dans du PBS pendant 10 minutes, suivie d'un traitement micro-ondes (5 minutes × 3 fois à 500 watts dans un tampon de citrate, pH 6). Ensuite, les coupes ont été incubées dans une solution de blocage (0,3 M de glycine, 50 mM de chlorure d'ammonium et 1% de BSA dans du PBS) pendant 30 minutes avant l'incubation dans les anticorps primaires. Les coupes ont été incubées avec des anticorps anti-merca1 ou -serca2 et anti-MHC I ou -MHCII (tableau 1) pendant 1 à 2 jours à 4 ◦C, puis lavés et incubés avec Alexa Fluor® 488 Donke ® 594 Abs secondaire IgG anti-igg Donkey pendant 1 heure à température ambiante. Le double IHC a été réalisé en utilisant des combinaisons (anti-merca1 + anti-secca2) et (anti-merca2 + anti-MHCII) pour vérifier la co-expression. Dans le double IHC, les mêmes étapes ont été effectuées avec un mélange d'anticorps primaires ou secondaires avec les mêmes dilutions.

Les coupes de tissus immunocolorées ont été examinées à l'aide d'un microscope confocal laser FV-1000 (Olympus, Tokyo, Japon). Le logiciel ImageJ 1.46 a été utilisé pour compter et calculer manuellement le pourcentage de cellules positives pour chaque anticorps.

Immunohistochimie pour le rat dénervé en 8 à 12 semaines, rats âgés, le larynx a été approché par une incision médiane en utilisant un microscope opérationnel standard sous anesthésie avec du pentobarbital de sodium. Après identification des nerfs laryngés récurrents droits et supérieurs, un segment de 1 cm a été retiré du nerf laryngé récurrent droit et les deux extrémités ont été ligaturées. Le nerf laryngé supérieur droit a également été divisé. Les groupes dénervés de rats ont été sacrifiés après 2, 4, 8 et 12 semaines. Le larynx a été collecté et préparé pour IHC en utilisant la même procédure décrite ci-dessus (n = 5 dans chaque groupe).

Sous-types du CMH en utilisant le typage des fibres multicolores:

Au début de nos recherches, nous avons essayé la section gelée. Après les essais de plusieurs techniques pour réduire l'autofluorescence et le bruit de fond, les enquêteurs n'ont pas eu de bonnes coloration. Ensuite, les enquêteurs ont interrompu le sous-typage du MHC et se sont déplacés vers des blocs à paraffine Analyse statistique La composition relative de SERCA et du CMH pour chaque muscle a été calculée. Les données disponibles pour le pourcentage cellulaire positif de chaque anticorps de rat ont été analysées statistiquement à l'aide du logiciel statistique SPSS, version 16. Des comparaisons statistiques ont été effectuées en utilisant le test t de l'élève bilatéral non apparié et ont été considérés comme significatifs à P <0,05.

Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc de Scheffe a été réalisée pour comparer la composition du MHC et du SERCA pour chaque muscle en dénervation avec le côté controlatéral et jeune avec l'âge. Les valeurs présentées sont des moyennes ± ET (écart-type), avec SD étant à travers les rats.