Differentielle SERCA -Expression in Kehlkopfmuskeln

In dieser Studie wurden als junge Ratten männliche Wistar-Ratten von männlichen erwachsenen Wistar (ShimiZu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japan), 8-12 Wochen im Alter von 280-350 g (n = 10) verwendet. Zusätzlich wurden 24 Monate alte Ratten (n = 10) als Altersmodelle verwendet.

Tiere der tierischen Gewebepräparation wurden mit einer intraperitonealen Injektion von Natriumpentobarbital (Dosis 30-60 mg/kg) anästhesiert und wurden nach einer Herzfusion mit 0,01 m phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Kehlkopf wurden sofort herausgeschnitten und ungefähr 12 Stunden lang bei (4 ° C) in das gleiche Fixiermittel eingetaucht. Die Gewebe wurden in Paraffin verarbeitet und unter Verwendung eines Mikrotoms (8-10 μm Dicke) geschnitten.

The intrinsic laryngeal muscles studied were: 1) medial and lateral thyroarytenoid (MTA, LTA), (2) lateral cricoarytenoid (LCA), (3) Superior cricoarytenoid (SCA), (4) posterior cricoarytenoid (PCA), and (5) Cricothyreoid (CT).

Immunhistochemie (IHC) Die Ermittler sahen sich in gefrorenen Abschnitten mit einer erfolglosen Identifizierung von Faserfasern gegenüber und dann in Paraffinabschnitte. Deparaffinisierte Schnitte wurden 10 Minuten lang mit 3% H2O2 in PBS inkubiert, gefolgt von einer Mikrowellenbehandlung (5 Minuten × 3 -mal bei 500 Watt in Citratpuffer, pH 6). Anschließend wurden die Schnitte in einer Blockierungslösung (0,3 M Glycin, 50 mM Ammoniumchlorid und 1% BSA in PBS) 30 Minuten vor der Inkubation in primären Antikörpern inkubiert. Die Schnitte wurden mit Anti-Serca1- oder -serca2- und Anti-MHC i oder -MHCII (Tabelle 1) Antikörper für 1-2 Tage bei 4 ° C, dann gewaschen und mit Alexa Fluor® 488 Esel-Anti-Maus-IgG und Fluor inkubiert ® 594 Donkey Anti-Goat IgG Sekundäres ABS für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Das Doppel-IHC wurde unter Verwendung von (Anti-Serca1 + Anti-Serca2) und (Anti-Serca2 + Anti-MHCII) -Kombinationen durchgeführt, um die Koexpression zu überprüfen. Im doppelten IHC wurden die gleichen Schritte mit einer Mischung aus primären oder sekundären Antikörpern mit denselben Verdünnungen durchgeführt.

Immunstierende Gewebeschnitte wurden unter Verwendung eines konfokalen FV-1000-Lasermikroskops (Olympus, Tokio, Japan) untersucht. ImageJ 1.46 -Software wurde verwendet, um den Prozentsatz positiver Zellen für jeden Antikörper manuell zu zählen und zu berechnen.

Immunhistochemie bei dervernten Ratten In 8-12 Wochen, gealterte Ratten, wurde der Larynx durch einen Mittellinienschnitt unter Verwendung eines Standard-Betriebsmikroskops unter Betäubung mit Natriumpentobarbital angesprochen. Nach der Identifizierung der rechten wiederkehrenden und überlegenen Kehlkopfnerven wurde ein 1 cm -Segment aus dem rechten wiederkehrenden Nervien des wiederkehrenden Kehlkopfes entfernt und beide Enden ligiert. Der rechte überlegene Kehlkopfnerv war ebenfalls geteilt. Die Denervierten Rattengruppen wurden nach 2, 4, 8 und 12 Wochen opfert. Der Kehlkopf wurde für IHC unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens gesammelt und vorbereitet (n = 5 in jeder Gruppe).

MHC-Subtypen mit mehrfarbiger Faser-Typisierung:

Zu Beginn unserer Forschung haben wir den gefrorenen Abschnitt ausprobiert. Nach Versuchen mit mehreren Techniken zur Verringerung der Autofluoreszenz und des Hintergrundrauschens konnten die Ermittler keine gute Färbung hatten. Anschließend setzten die Ermittler MHC-Subtyping ab und verschoben in die statistische Analyse von Paraffin-eingebetteten Blöcken. Die relative SERCA- und MHC-Zusammensetzung für jeden Muskel wurde berechnet. Die verfügbaren Daten für den positiven Zellprozentsatz jedes Rattenantikörpers wurden statistisch unter Verwendung der statistischen SPSS -Software, Version 16, statistisch analysiert. Statistische Vergleiche wurden unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen Student-T-Tests durchgeführt und wurden bei P <0,05 als signifikant angesehen.

Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Scheffes Post-Hoc-Test, wurde durchgeführt, um die MHC- und SERCA-Komposition für jeden Muskel in der Denervierung mit der kontralateralen Seite und jung mit dem Alter zu vergleichen. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± SD (Standardabweichung), wobei SD über Ratten hinweg liegt.