Differentiaal SERCA -expressie in larynxspieren

Dieren in deze studie, mannelijke volwassen Wistar-ratten (Shimizu Laboratory Supplies Co., Kyoto, Japan), 8-12 weken oud, met een gewicht van 280-350 g (n = 10) werden gebruikt als jonge ratten. Bovendien werden 24 maanden oude ratten (n = 10) gebruikt als oude modellen.

Dieren van dierenweefsel waren verdoofd met een intraperitoneale injectie van natrium pentobarbital (dosis 30-60 mg/kg) en werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde na hartperfusie met 0,01 m fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). De strottenhuizen werden onmiddellijk uitgesneden en gedurende ongeveer 12 uur in hetzelfde fixeermiddel ondergedompeld bij (4 ° C). Weefsels werden verwerkt in paraffine en in secties met een microtome (8-10 urn dikte).

De intrinsieke bestudeerde larynxspieren waren: 1) Mediale en laterale thyroarytenoid (MTA, LTA), (2) Laterale cricoarytenoid (LCA), (3) Superior Cricoarytenoid (SCA), (4) Posterieure cricoarytenoid (PCA) en (5) Cricothyroid (CT).

Immunohistochemie (IHC) De onderzoekers werden geconfronteerd met niet -succesvolle identificatie van snelle vezels op bevroren secties en we verschoven naar paraffinesecties. Deparaffiniseerde secties werden gedurende 10 minuten geïncubeerd met 3% H2O2 in PBS gevolgd door magnetronbehandeling (5 minuten 3 keer bij 500 watt in citraatbuffer, pH 6). Vervolgens werden secties geïncubeerd in een blokkeeroplossing (0,3 M glycine, 50 mM ammoniumchloride en 1% BSA in PBS) gedurende 30 minuten vóór incubatie in primaire antilichamen. Secties werden geïncubeerd met anti-SERCA1 of -SERCA2 en anti-MHC I of -MHCII (tabel 1) antilichamen gedurende 1-2 dagen bij 4 ° C, vervolgens gewassen en geïncubeerd met Alexa Fluor® 488 Donkey Anti-Mouse IGG en Fluor ® 594 Donkey Anti-beat IgG Secundaire ABS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Dubbele IHC werd uitgevoerd met behulp van (anti-Serca1 + anti-Serca2) en (anti-Serca2 + anti-MHCII) combinaties om co-expressie te controleren. In dubbele IHC werden dezelfde stappen uitgevoerd met een mengsel van primaire of secundaire antilichamen met dezelfde verdunningen.

Immunokleurige weefselsecties werden onderzocht met behulp van een FV-1000 laserconfocale microscoop (Olympus, Tokyo, Japan). ImageJ 1.46 -software werd gebruikt om het percentage positieve cellen voor elk antilichaam handmatig te tellen en te berekenen.

Immunohistochemie voor gedenerveerde rat in 8-12 weken, oude ratten, het strottenhoofd werd benaderd door een middellijn incisie met behulp van een standaardbedrijfsmicroscoop onder anesthesie met natrium pentobarbital. Na identificatie van de rechter terugkerende en superieure larynxzenuwen werd een segment van 1 cm verwijderd van de rechter terugkerende larynxzenuw en beide uiteinden werden geligeerd. De juiste superieure larynxale zenuw was ook verdeeld. De gedenerveerde rattengroepen werden na 2, 4, 8 en 12 weken opgeofferd. Het strottenhoofd werd verzameld en voorbereid op IHC met behulp van dezelfde hierboven beschreven procedure (n = 5 in elke groep).

MHC-subtypen met behulp van veelkleurige vezeltypen:

Aan het begin van ons onderzoek hebben we de bevroren sectie geprobeerd. Na proeven met verschillende technieken om autofluorescentie en achtergrondgeluid te verminderen, hebben de onderzoekers geen goede kleuring. Vervolgens stopten de onderzoekers MHC Subtyping en verschoven naar paraffine ingebedde blokken statistische analyse De relatieve SERCA en MHC-samenstelling voor elke spier werd berekend. De beschikbare gegevens voor het positieve celpercentage van elk rattenantilichaam werden statistisch geanalyseerd met behulp van SPSS -statistische software, versie 16. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de ongepaarde tweestaartige student's t-test en werden als significant beschouwd bij P <0,05.

Variantieanalyse van één richting (ANOVA) gevolgd door Scheffe's post-hoc test werd uitgevoerd om de MHC- en SERCA-samenstelling voor elke spier in denervatie te vergelijken met de contralaterale zijde en jong met de leeftijd. De gepresenteerde waarden zijn gemiddelden ± SD (standaardafwijking), waarbij SD tussen ratten is.