糞便微生物叢の組成、代謝産物濃度、および硫酸インドキシルレベルとの関連

患者と研究デザイン

Tungs 'Taichung Metroharbour Hospitalの腎師団である透析ユニットから60人のHD患者が登録されます。 研究に参加するという書面によるインフォームドコンセントは、研究デザインと目的について通知された後、各参加者から得られます。 実験プロトコルは、IRBの倫理委員会に承認を求めて派遣されます。 包含基準は18〜80歳で、CKDステージVと診断されています（現在、血液透析治療を3か月> 3か月）。 除外基準には、妊娠または看護の女性が含まれます。腎臓移植、重度の感染症、重度の心臓病および肝臓疾患、悪性腫瘍、自己免疫疾患、重度の栄養失調の患者。研究開始から1か月以内に、あらゆる種類の前またはプロバイオティクスを消費するか、抗生物質療法を受けました。過敏性腸症候群、クローン病、または潰瘍性大腸炎の診断。腸の放射線を受け取ったり、大腸切除を受けたりしたことがあります。参加者は食事の指示を受け、患者のインタビュー中に栄養アンケートによって定量化される安定した食事摂取量を維持することをお勧めします。 アンケートは、食品と飲み物の消費の毎週の量と頻度に関する情報を収集しました。 さまざまな食品の栄養素組成に関するデータは、国立台湾大学栄養食品安全研究所のテーブルを使用して取得されます。

サンプルの収集、準備、分析の血液サンプルは、各参加者とは別に収集されます。 血液サンプルは、フッ化ナトリウムチューブを使用して、8〜12時間の空腹時に収集され、研究室に移動するまで氷上に保管されます。 そこに行くと、サンプルを4°Cで15分間、3,000×gで遠心分離します。 次に、血清を滅菌チューブに移し、将来の分析のために-20°Cで保存します。

酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸、およびバルレートの血清レベルを測定し、イソブチレートやイソバレートなどの分岐鎖SCFAを測定します。 これらの代謝産物プロファイルは、超高形液液液クロマトグラフィマス分析（UPLC-MS）を使用して分析されます。 簡単に言えば、各血清サンプル100μlを1.5 mlの微小管、20 mgのNaCl、10 mgのクエン酸、20μLの1 M HCl、および100μLのブタノールと混合します。 混合物を2分間ボルテックス化し、18,000×gで15分間遠心分離します。 結果として得られる上清は、分析のために新鮮な微小管に移されます。

尿毒症毒素の測定自由レベルではなく、総尿毒症毒素レベルを測定します。 総硫酸インドキシル、p-クレシル硫酸、インドール-3-酢酸（IAA）、およびhipp骨酸の濃度は、前述の方法[19]を使用して中央に定量化されます。 簡単に言えば、結合競合のために、200μLの血清を20μlの0.50mm 0.50mm 1-ナフタレンスルホン酸（内部標準）に250μLの0.24M 0.24Mオクタノ酸ナトリウム（結合競争相手）と渦ミキシングしました。室温で5分間インキュベーションした後、2mLコールドアセトンを加えてタンパク質を加えました。 渦混合および4℃、1860×gで20分間遠心分離した後、上清を12mm×100mm、GL 14ガラス試験チューブ、2mlのジクロロメタンに移しました。 渦混合および4℃での遠心分離後、1860×gで10分間、200μLの上層をガラスオートサンプラーバイアルに移し、その後20μL1MHClを添加し、15μLをHPLCに注入しました。 HPLC分析は、Agilent 1100シリーズLC（Santa Clara、CA）で実行され、Agilent Chemstationsソフトウェアがクロマトグラフィー分析に使用されました。 分離は、0.6 mL/minの流量で、Zorbax SB-C18 SOLV SAVER PLUS HPLCカラム（5μm、3.0 mm×150 mm）で実行されました。 移動相Aは、Milli-Q水で0.2％トリフルオロ酢酸であり、移動相Bはアセトニトリルでは0.2％トリフルオロ酢酸です。 分析方法は、92％の移動相Aで23分間のISOCRATIC Runで構成されています。 各分析ランの後に1.3分のウォッシュアウト勾配が100％Bに続きました。カラム温度は25℃で、オートサンプラートレイ温度は6℃でした。 Agilent 1100高性能蛍光検出器G1321AおよびAgilent 1100シリーズUV可視検出器G1314Aのアジレントの標準ピーク面積比を使用して、分析物を定量化しました。 検出器の設定は、p-クレシル硫酸の場合はλex260 nm/λem288nm、硫酸インドキシル、インドール-3-酢酸、および内部標準ではλex280 nm/λem390nmでした。 hippur酸は、254 nmのUV-Vis検出器によって監視されました。 定量的結果は、濃度（mg/L）の観点から得られ、計算されます。

糞便微生物叢プロファイルサンプル収集資格のある便サンプルは、被験者によって滅菌凍結チューブで自己収集され、すぐにラボに輸送され、さらにテストのために-80℃で保管されていました。

糞便サンプルからのDNA抽出とシーケンスゲノムDNAは、メーカーのガイドラインに従ってQiagen DNA Stool Fast Kit（Qiagen）を使用して抽出されます。 抽出されたメタゲノムDNAの品質は、1.0％アガロースゲル電気泳動および分光光度分析（260/280 nm比で光学密度を測定）を通じて評価されます。 抽出されたDNAが適切であると見なされるためには、濃度は20 ng/μLを超えなければならず、1.8〜2.0の範囲内で260/280 nmの比率があります。 細菌16S RRNA遺伝子の可変領域4（V4）は、サンプル識別用のバーコードを含む細菌/古細菌プライマー515F/806Rを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を介して増幅されます[20]。 得られたアンプリコンは、Genejet Gel Extraction Kit（Thermo Scientific）を使用して精製され、Qubit 2.0蛍光計（qubit）のqubit dsdna HSアッセイキットで定量化されます。 シーケンスライブラリは、メーカーのプロトコルに従って、nebnext®ウルトラ™DNAライブラリプレップキット（NEB）を使用して準備されています。 精製されたライブラリは、定量化、正規化、プールされ、クラスター生成とイルミナHiseq 2500プラットフォームでのシーケンスに使用され、250 bpのペアエンド読み取りが生成されます。

ペアエンド読み取りは、Flash V1.2.7 [21]を使用してマージされ、Pythonスクリプト[22]を使用したQIIME 1.7パイプラインを使用して品質フィルタリングが実行されます。 キメラシーケンスはUCHIMEによって除去されました[23]。 処理された読み取り（効果的なタグ）は、97％シーケンスアイデンティティを使用して運用分類単位（OTU）にクラスター化され[24]、分類学的分類はSilvaデータベース[25]に基づいて割り当てられます。 異なるOTUの系統発生関係を評価するために、Silvaデータベースに対してPynast V1.2 [26]を使用して複数の配列アラインメントが実行され、FastTree [27]を使用して系統樹が構築されました。

アルファの多様性は、OTUレベルでChao1インデックスを使用して種の豊富さによって推定されます。 希薄化曲線は、各サンプルのシーケンスデータのサブセットをランダムに選択して、観察された種の数を表すことによって生成され、種の蓄積曲線がプロットされ、連続サンプリングを伴う新しいOTU（種）の発生を示すものがプロットされます。 ベータの多様性については、OTUレベルでのBray-Curtisの非類似性が計算され、ビーガンパッケージ[28]を使用して分析されます。 主要な座標分析（PCOA）は、Bray-Curtis距離に基づいて行われ、重み付きUNIFRACパラメーターと非加重UNIFRACパラメーターの両方がQIIMEパイプラインを介して計算されます。 非メトリック寸法スケーリング（NMDS）は、加重相関ネットワーク分析（WGCNA）、STAT、およびGGPLOT2パッケージを使用して実行されます。 すべての分析は、特に指定されていない限り、社内Rスクリプトを使用して実行されます。

メタゲノムの機能的組成は、Pythonスクリプトを使用したPicRustソフトウェアを使用して16S RRNAデータから予測されます[30]。 IMGデータベース[32]に基づいて、シーケンスされた細菌および古細菌ゲノムからの各遺伝子ファミリーの遺伝子コピー数の事前計算されたテーブルと、Greengenesデータベース[32]の系統樹は、遺伝子含有量の予測に使用されます。