Fekaalisen mikrobiotakoostumuksen, metaboliittipitoisuuksien ja indoksyylisulfaattitasojen välinen yhteys

Potilaat ja tutkimussuunnitelma

Kuusikymmentä HD -potilasta otetaan mukaan dialyysiyksiköstä, Tungsin Taichung Metroharbour -sairaalan munuaisosasto. Jokaiselta osallistujalta saadaan kirjallinen tietoinen suostumus osallistumaan tutkimukseen sen jälkeen, kun hänelle on annettu tietoa tutkimuksen suunnittelusta ja tavoitteista. Kokeellinen protokolla lähettää IRB: n eettisille komiteoille hyväksyttäväksi. Sisällyttämiskriteerit ovat ikä 18–80 vuotta ja diagnosoitu CKD-vaihe V (tällä hetkellä saava hemodialyysihoito> 3 kuukautta). Poissulkemiskriteerit sisälsivät raskaana olevia tai imettäviä naisia; potilaat, joilla on munuaisensiirto, vakavat infektiot, vakavat sydänsairaudet ja maksasairaudet, pahanlaatuisuus, autoimmuunisairaudet, vakava aliravitsemus; kuluttaa minkä tahansa tyyppisiä esio- tai probiootteja tai heillä oli antibioottihoito yhden kuukauden kuluessa tutkimuksen alkamisesta; diagnosoitu ärtyvän suolen oireyhtymä, Crohnin tauti tai haavainen koliitti; Suolen säteilyn vastaanottaminen tai saanut suuren suolen resektion. Osallistujat saavat ruokavalio -ohjeita ja heitä rohkaistaan ​​ylläpitämään vakaata ruokavalion saantia, jonka ravitsemuskyselyt kvantifioivat potilashaastattelujen aikana. Kyselylomakkeet keräsivät tietoa viikoittaisesta määrästä ja taajuudesta ruoan ja juomien kulutuksesta. Tiedot eri elintarvikkeiden ravintoaineiden koostumuksesta saadaan käyttämällä ravitsemus- ja elintarviketurvallisuusinstituutin taulukoita, Kansallinen Taiwanin yliopisto.

Näytteenkeruu, valmistus ja analysointi Verinäytteet kerätään erikseen jokaisesta osallistujasta. Verinäytteet kerätään 8-12 tunnin paastojakson jälkeen käyttämällä natriumfluoridiputkia ja pidetään jäällä siirtymään tutkimuslaboratorioon. Siellä ollessa näytteet sentrifugoivat 3000 x g: llä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Seerumi siirretään sitten steriileihin putkiin ja säilytetään -20 ° C: seen tulevaa analyysiä varten.

Mittaamme asetaatin, propionaatin, butyraatin ja valeraatin seerumin tasot sekä haarautuneiden ketjun SCFA: n, kuten isobutyraatin ja isovalaatin, kanssa. Nämä metaboliittiprofiilit analysoidaan käyttämällä ultrafformanssin nestekromatografia-massaspektrometriaa (UPLC-MS). Lyhyesti sanottuna 100 μl kutakin seeruminäytettä sekoitetaan 1,5 ml: n mikrotubeihin, joissa on 20 mg NaCl, 10 mg sitruunahappoa, 20 μl 1 M HCl ja 100 μl butanolia. Seos vorteksidaan 2 minuutin ajan ja sentrifugoituu sitten 18 000 x g 15 minuutin ajan. Tuloksena oleva supernatantti siirretään tuoreisiin mikrotubeihin analysoitavaksi.

Ureemisten toksiinien mittaus mittaamme kokonais -ureemisen toksiinin tasot vapaiden tasojen sijasta. Kokonaisdoksyylisulfaatin, p-dresyylisulfaatin, indoli-3-etikkahapon (IAA) ja hippurihapon pitoisuudet määritetään keskitetysti käyttämällä aiemmin kuvattua menetelmää [19]. Lyhyesti, sitoutumiskilpailussa 200 μl seerumia, johon lisäsimme 20 μl 0,50 mm 1-naftaleenisulfonihappoa (sisäinen standardi), sekoitettiin 250 μl: n 0,24 m: n natriumoktaanoaatilla (sitova kilpailija). Siirron jälkeen viiden minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa lisäsimme 2 ml: n kylmää asetonia proteiinien saostumiseen. Vortex-sekoittamisen ja sentrifugoitumisen jälkeen 4 ° C: ssa 1860 x g 20 minuutin ajan supernatantti siirrettiin 12 mm × 100 mm, GL 14 lasi-testiputkiin ja 2 ml: n dikloorimetaaniin. Vortex-sekoittamisen ja sentrifugoitumisen jälkeen 4 ° C: ssa 1860 x g 10 minuutin ajan, 200 μl ylemmästä kerroksesta siirrettiin Glass Autosampler -vipuihin, mitä seurasi 20 μL 1M HCl ja 15 μl injektoitiin HPLC: lle. HPLC -analyysi suoritettiin Agilent 1100 -sarjan LC: lle (Santa Clara, CA), ja kromatografiseen analyysiin käytettiin Agilent Chemstations -ohjelmistoa. Erottelu suoritettiin Zorbax SB-C18 -liuottehäisellä Plus HPLC -pylväällä (5 μm, 3,0 mm × 150 mm). Virtausnopeudella 0,6 ml/min. Liikkuva vaihe A on 0,2% trifluorietikkahappo milli-Q-vedessä ja liikkuva faasi B on 0,2% trifluorietikkahappoa asetonitriilissä. Analyyttinen menetelmä koostuu isokraattisesta juoksusta 92%: n liikkuvan vaiheen A kanssa 23 minuutin ajan. Jokaista analyyttistä ajoa seurasi 1,3 minuutin pesugradientti 100% B. Pylvään lämpötila oli 25 ° C ja automaattinen näytteenottimen lämpötila oli 6 ° C. Kvantifioimme analyyttit käyttämällä analyyttiä tavanomaiseen piikkien suhteeseen Agilent 1100 korkean suorituskyvyn fluoresenssin ilmaisimella G1321A ja Agilent 1100 -sarjan UV-näkyvät ilmaisimet G1314a. Ilmaisinasetukset olivat λex 260 nm/λem288nm p-kresyylisulfaatille ja λex 280 nm/λem 390Nm indoksyylisulfaatille, indoli-3-etikkahapolle ja sisäiselle standardille. UV-Vis-ilmaisin tarkkailtiin hippuriinihappoa 254 nm: n nopeudella. Kvantitatiiviset tulokset saadaan ja lasketaan niiden pitoisuuksien perusteella (mg/l).

Fekaalin mikrobiotaprofiilinäytteen kerääminen pätevät ulostenäytteet ovat itse kerättyjä steriileissä jäädytetyissä putkissa koehenkilöillä ja ne kuljetettiin välittömästi laboratorioon, jossa niitä varastoitiin - 80 ° C lisätestausta varten.

Fekaalinäytteistä peräisin olevista DNA -uutto- ja sekvensointi genominen DNA uutetaan käyttämällä Qiagen DNA -jakkaran nopeaa pakkausta (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutetun metagenomisen DNA: n laatu arvioidaan 1,0 -prosenttisella agaroosigeelielektroforeesilla ja spektrofotometrisella analyysillä (optisen tiheyden mittaaminen 260/280 nm: n suhteen). Jotta uutetun DNA: n voidaan pitää sopivana, konsentraation on ylitettävä 20 ng/μl, ja suhteessa 260/280 nm: n välillä 1,8 - 2,0. Bakteerien 16S -rRNA -geenin muuttuva alue 4 (V4) monistetaan polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla bakteerien/arkaialomuomien kanssa 515F/806R, mukaan lukien viivakoodit näytteen tunnistamiseksi [20]. Tuloksena olevat amplikonit puhdistetaan käyttämällä Genejet -geeliuuttopakkausta (Thermo Scientific) ja kvantifioitu qubit dsDNA HS -määrityspakkauksella Qubit 2.0 -fluorometrillä (QBIT). Sekvensointikirjastot valmistetaan käyttämällä NebNext® ULTRA ™ DNA -kirjaston prep -sarjaa Illuminalle (NEB) valmistajan protokollan mukaisesti. Puhdistetut kirjastot määritetään, normalisoidaan, yhdistetään ja käytetään sitten klusterin luomiseen ja sekvensoinnissa Illumina HiSeq 2500 -alustalla, joka tuottaa 250 bp: n parillisen pääluku.

Parillisen pääluku yhdistetään käyttämällä Flash v1.2.7 [21], ja laadun suodatus suoritetaan käyttämällä QIIME 1.7 -putkilinjaa python-skripteillä [22]. Kimeeriset sekvenssit poistettiin Uchimella [23]. Käsitellyt lukemat (tehokkaat tunnisteet) on ryhmitelty operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTUS) 97%: n sekvenssi -identiteettillä käyttämällä Uparseja [24], ja taksonominen luokittelu määritetään SILVA -tietokannan perusteella [25]. Eri OTU: n fylogeneettisten suhteiden arvioimiseksi suoritetaan useita sekvenssien kohdistuksia käyttämällä Pynast V1.2 [26] SILVA -tietokantaa vastaan ​​ja fylogeneettinen puu rakennettiin Fasttree -käyttämällä [27].

Alfa -monimuotoisuus arvioidaan lajien rikkaudella käyttämällä CHAO1 -indeksiä OTU -tasolla. Rarefaktiokäyrä syntyy valitsemalla satunnaisesti sekvensointitietojen alajoukko jokaisesta näytteestä havaittujen lajien lukumäärän edustamiseksi, ja lajien kertymiskäyrä on piirretty osoittamaan uuden OTU: n (lajien) esiintyminen jatkuvalla näytteenottoon. Beeta-monimuotoisuuden kannalta Bray-Curtis-erot OTU-tasolla lasketaan ja analysoidaan vegaanipakettia käyttämällä [28]. Pääkoordinaattianalyysi (PCOA) suoritetaan Bray-Curtis-etäisyyksien perusteella, ja sekä painotetut että painottamattomat UniFRAC-parametrit [29] lasketaan QIIME-putkilinjan kautta. Ei-metrinen ulottuvuuden skaalaus (NMDS) suoritetaan käyttämällä painotettua korrelaatioverkkoanalyysiä (WGCNA), STAT ja GGPLOT2-paketteja R: ssä muuttamalla painotettujen ja painottamattomien UNIFRAC-parametrien etäisyysmatriisi uuteen ortogonaalisten akselien joukkoon. Kaikki analyysit suoritetaan käyttämällä sisäisiä R-skriptejä, ellei toisin mainita.

Metagenomien funktionaalinen koostumus ennustetaan 16S RRNA -tiedoista käyttämällä PICRUST -ohjelmistoa python -skripteillä [30]. Geenipitoisuuteen perustuen GreenGenes -tietokannasta [32], geenikopioiden lukumäärä jokaiselle geeniperheelle sekvensoiduista bakteeri- ja arkaaligenomeista, jotka perustuvat IMG -tietokantaan [32], käytetään geenipitoisuuden ennustamiseen.