Assosiasjon mellom fekal mikrobiotasammensetning, metabolittkonsentrasjoner og indoksylsulfatnivåer

Pasienter og studiedesign

Seksti HD -pasienter vil bli registrert, fra dialyseenhet, nyredeling av Tungs 'Taichung Metroharbour Hospital. Det skriftlige informerte samtykket til å delta i studien oppnås fra hver deltaker etter å ha blitt informert om studiedesign og mål. Den eksperimentelle protokollen vil sende til de etiske komiteene i IRB for godkjenning. Inkluderingskriterier er 18-80 år og diagnostisert med CKD-trinn V (mottar for tiden hemodialysebehandling> 3 måneder). Eksklusjonskriterier inkluderte gravide eller sykepleierkvinner; pasienter med nyretransplantasjon, alvorlige infeksjoner, alvorlige hjertesykdommer og leversykdommer, malignitet, autoimmune lidelser, alvorlig underernæring; konsumerte enhver form for pre-eller probiotika eller hadde antibiotikabehandling innen 1 måned etter studiestart; diagnostisert irritabelt tarmsyndrom, Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt; Mottakelse eller har fått tarmstråling eller hatt av tarmreseksjon. Spørreskjemaene samlet informasjon om ukentlig mengde og hyppighet av mat og drikkeforbruk. Data om næringssammensetningen til de forskjellige matvarene oppnås ved bruk av tabellene til Institute of Nutrition and Food Safety, National Taiwan University.

Eksempelinnsamling, forberedelse og analyse Blodprøver blir samlet separat fra hver deltaker. Blodprøver blir samlet etter en fasteperiode på 8 til 12 timer ved bruk av natriumfluoridrør, og holdes på is til overføring til forskningslaboratoriet. Når de er der, blir prøvene sentrifugert ved 3000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Serumet overføres deretter til sterile rør og lagres ved -20 ° C for fremtidig analyse.

Vi måler serumnivåer av acetat, propionat, butyrat og valerat, sammen med forgrenede SCFA-er som isobutyrat og isovalerat. Disse metabolittprofilene blir analysert ved bruk av ultraperformance væskekromatografimasse-spektrometri (UPLC-MS). I korte trekk blandes 100 ul av hver serumprøve i 1,5 ml mikrotubes med 20 mg NaCl, 10 mg sitronsyre, 20 ul 1 m HCl og 100 ul butanol. Blandingen er virvlet i 2 minutter og sentrifuges deretter ved 18.000 x g i 15 minutter. Den resulterende supernatanten overføres til ferske mikrotubes for analyse.

Måling av uremiske giftstoffer Vi måler totale uremiske toksinnivåer i stedet for frie nivåer. Konsentrasjonene av total indoksylsulfat, p-cresylsulfat, indol-3-eddiksyre (IAA) og hippursyre blir sentralt kvantifisert ved bruk av en tidligere beskrevet metode [19]. Kort fortalt, for bindingskonkurranse, ble 200 ul serum som vi la til 20μL 0,50 mm 1-naftalenesulfonsyre (intern standard) virvelblandet med 250μL 0,24 m natriumoktano (bindende konkurrent). Etter inkubasjon ved romtemperatur for 5-minutters, la vi 2ML Cold Acetone To Precubation. Etter virvelblanding og sentrifugering ved 4 ◦C, 1860 × g i 20 minutter, ble supernatanten overført til 12mm × 100mm, GL 14 glass-testrør og 2 ml diklormetan ble tilsatt. Etter virvelblanding og sentrifugering ved 4 ◦C, 1860 × g i 10 minutter, ble 200 ul av det øvre laget overført til glass autosampler hetteglass, fulgt av tilsetning av 20 ul 1M HCl og 15μL ble injisert på HPLC. HPLC -analysen ble utført på en Agilent 1100 -serie LC (Santa Clara, CA), og Agilent Chemstations -programvare ble brukt til den kromatografiske analysen. Separasjonen ble utført på en Zorbax SB-C18 Solv Saver pluss HPLC-kolonne (5 μm, 3,0 mm × 150 mm). Til en strømningshastighet på 0,6 ml/min. Mobil fase A er 0,2% trifluoreddiksyre i milli-q vann og mobil fase B er 0,2% trifluoreddiksyre i acetonitril. Den analytiske metoden består av et isokratisk løp med 92% mobil fase A i 23 minutter .. Hver analytiske kjøring ble fulgt av en 1,3 min utvaskingsgradient til 100% B. Kolonnemperatur var 25 ° C, og autosampler -brett temperatur var 6 ◦C. Vi kvantifiserte analyttene ved å bruke analytten til standard topp arealforhold på en Agilent 1100 høyytelsesfluorescensdetektor G1321A og Agilent 1100-serie UV-synlige detektorer G1314A. Detektorinnstillinger var λex 260 nm/λem288nm for p-cresylsulfat og λex 280 nm/λem 390nm for indoksylsulfat, indol-3-eddiksyre og intern standard. Hippursyre ble overvåket av UV-Vis detektor ved 254 nm. Kvantitative resultater oppnås og beregnet i form av konsentrasjoner (mg/l).

Fekale mikrobiota -profilprøveinnsamling Kvalifiserte avføringsprøver er selvinnsamlet i sterile frosne rør av forsøkspersoner og ble transportert umiddelbart til laboratoriet der de ble lagret på - 80 ◦C for videre testing.

DNA -ekstraksjon og sekvensering av genomisk DNA fra fekale prøver blir trukket ut ved bruk av Qiagen DNA -avføringen Fast Kit (Qiagen) i henhold til produsentens retningslinjer. Kvaliteten på det ekstraherte metagenomiske DNA blir vurdert gjennom 1,0% agarosegelelektroforese og spektrofotometrisk analyse (måling av den optiske tettheten i et forhold på 260/280 nm). For at det ekstraherte DNA skal anses som egnet, må konsentrasjonen overstige 20 ng/μL, med et forhold på 260/280 nm innenfor området 1,8 til 2,0. Det variable region 4 (V4) av bakteriell 16S rRNA -gen forsterkes gjennom polymerasekjedereaksjon (PCR) med bakterielle/archaeal primere 515F/806R, inkludert strekkoder for prøveidentifikasjon [20]. De resulterende amplikonene blir renset ved bruk av Genejet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) og kvantifiseres med et Quit DSDNA HS -analysesett på et qubit 2.0 -fluorometer (QUBIT). Sekvenseringsbiblioteker er utarbeidet ved hjelp av NEBNext® Ultra ™ DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB), etter produsentens protokoll. De rensede bibliotekene blir kvantifisert, normalisert, samlet og bruker deretter til klynggenerering og sekvensering på en Illumina HiSeq 2500-plattform for å produsere 250 bp sammenkoblede avlesninger.

Parede endeavlesninger blir slått sammen ved hjelp av Flash v1.2.7 [21], og kvalitetsfiltrering utføres ved hjelp av QIIME 1.7-rørledningen med Python-skript [22]. Kimære sekvenser ble fjernet med Uchime [23]. De behandlede avlesningene (effektive tagger) blir gruppert til operasjonelle taksonomiske enheter (OTU) ved 97% sekvensidentitet ved bruk av Uparse [24], og taksonomisk klassifisering er tildelt basert på SILVA -databasen [25]. For å vurdere de fylogenetiske forholdene til forskjellige OTU -er, utføres flere sekvensjusteringer ved bruk av Pynast v1.2 [26] mot Silva -databasen, og et fylogenetisk tre ble konstruert ved bruk av FastTree [27].

Alfa -mangfoldet er estimert av artsrikdom ved bruk av Chao1 -indeksen på OTU -nivå. En rarefaction -kurve genereres ved tilfeldig å velge en undergruppe av sekvenseringsdata fra hver prøve for å representere antall observerte arter, og en artsakkumuleringskurve plottes for å vise forekomsten av nye OTU -er (art) med kontinuerlig prøvetaking. For beta-mangfold blir Bray-Curtis ulikheter på OTU-nivå beregnet og analysert ved bruk av den veganske pakken [28]. Hovedkoordinatanalyse (PCOA) gjennomføres basert på avstander fra Bray-Curtis, og både vektede og uvektede UniFRAC-parametere [29] beregnes gjennom Qiime-rørledningen. Ikke-metrisk dimensjonal skalering (NMDS) utføres ved bruk av den vektede korrelasjonsnettverksanalysen (WGCNA), STAT og GGPLOT2-pakker i R ved å transformere en avstandsmatrise av vektede og uvektede UniFRAC-parametere til et nytt sett med ortogonale akser. Alle analyser gjennomføres ved hjelp av interne R-skript, med mindre annet er spesifisert.

Funksjonell sammensetning av metagenomer er spådd fra 16S rRNA -data ved bruk av Picrust -programvaren med Python -skript [30]. En forhåndsbestemt tabell med genkopi -tall for hver genfamilie fra sekvenserte bakterie- og archaealgenomer, basert på IMG -databasen [32], sammen med et fylogenetisk tre fra GreenGenes -databasen [32], brukes til geninnholds prediksjon.