Ассоциация между составом фекальной микробиоты, концентрациями метаболита и уровнями индоксилсульфата

Пациенты и дизайн исследования

Шестьдесят пациентов с HD будут зачислены из диализа, почечного деления в Тунгс -метро -метро -больнице. Письменное информированное согласие на участие в исследовании получается от каждого участника после того, как его информируют о дизайне и целях исследования. Экспериментальный протокол отправится в этические комитеты IRB для утверждения. Критерии включения составляют возраст 18-80 лет и диагностированы с ХБП-стадией V (в настоящее время лечение гемодиализа> 3 месяца). Критерии исключения включали беременных или уход за женщинами; Пациенты с пересадкой почек, тяжелыми инфекциями, тяжелыми сердечными заболеваниями и заболеваниями печени, злокачественными новообразованиями, аутоиммунными расстройствами, тяжелым недоеданием; потреблял любой тип преобиотиков или пробиотики или проходила антибиотикотерапию в течение 1 месяца после начала исследования; диагностированный синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона или язвенной колит; Получение или получение излучения кишечника или имела большую резекцию кишечника, участники получат диетические инструкции и рекомендуются поддерживать стабильное потребление питания, которое количественно определяется по вопросам питания во время интервью с пациентами. Анкеты собрали информацию о еженедельном количестве и частоте потребления продуктов питания и напитков. Данные, касающиеся состава питательных веществ различных продуктов, получаются с использованием таблиц Института питания и безопасности пищевых продуктов, Национальный Тайваньский университет.

Сбор образцов, подготовка и анализ образцы крови собираются отдельно от каждого участника. Образцы крови собираются после 8-12-часового периода поста, используя фторидные трубки натрия и сохраняются на льду до переноса в исследовательскую лабораторию. Оказавшись там, образцы центрифугируют при 3000 × g в течение 15 минут при 4 ° C. Затем сыворотку переносятся в стерильные трубки и сохраняют при -20 ° C для будущего анализа.

Мы измеряем уровни ацетата, пропионата, бутирата и валерата сыворотки, а также SCFA с разветвленной цепью, такие как изобутират и изовалерат. Эти профили метаболитов анализируются с использованием ультраверформированной жидкой хроматографической спектрометрии (UPLC-MS). Вкратце, 100 мкл каждого сывороточного образца смешивают в 1,5 мл микротрубки с 20 мг NaCl, 10 мг лимонной кислоты, 20 мкл 1 м HCl и 100 мкл бутанола. Смесь встряхивают в течение 2 минут, а затем центрифугируют при 18000 × g в течение 15 минут. Полученный супернатант переносятся на свежие микротрубки для анализа.

Измерение уремических токсинов мы измеряем общий урем -уровни токсина, а не свободные уровни. Концентрации общего индоксилсульфата, P-кризилсульфата, индола-3-уксусной кислоты (IAA) и гиппурной кислоты центрированы по центрально количественно с использованием ранее описанного метода [19]. Вкратце, для конкуренции по связыванию, 200 мкл сыворотки, к которой мы добавили 20 мкл 0,50 мм 1-на-на-на-нафталенсульфокислоты (внутренний стандарт), была вихрела с смешиванием 250 мкл 0,24 м натриевого октанотата (конкурента связывания). Через инкубацию при комнатной температуре в течение 5 минут мы добавили 2 мл ацетона холодного ацетона, чтобы ускорить белки. После смешивания вихря и центрифугирования при 4 ° С, 1860 × g в течение 20 минут, супернатант переносили в 12 мм × 100 мм, GL 14 стеклянных пробирок и 2 мл дихлорметана. После вихревого смешивания и центрифугирования при 4 ° С, 1860 × g в течение 10 минут, 200 мкл верхнего слоя переносили в флаконы с аутосамплером стекла, а затем добавление 20 мкл 1M HCl и 15 мкл вводили в ВЭЖХ. Анализ ВЭЖХ был выполнен на LC Agilent 1100 Series (Santa Clara, CA), и для хроматографического анализа использовались программное обеспечение Agilent Chemstations. Разделение проводили на Solv Solv Sover Saver Plus Zorbax SB-C18 (5 мкм, 3,0 мм × 150 мм). В скорости потока 0,6 мл/мин. Подвижная фаза A составляет 0,2% трифторуксусной кислоты в воде Milli-Q, а подвижная фаза B составляет 0,2% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. Аналитический метод состоит из изократического прогона с 92% подвижной фазой A в течение 23 минут. Каждый аналитический прогон сопровождался 1,3 -минутным градиентом вымывания до 100% B. Температура столбца составляла 25 ° C, а температура лотка Autosampler составляла 6 ° C. Мы количественно определили аналиты, используя аналит к стандартному соотношению площади пика на высокоэффективном детекторе флуоресценции Agilent 1100 G1321A и Agilent 1100-й серии УФ-видимых детекторов G1314A. Настройки детектора представляли собой λex 260 нм/λem288nm для p-крезилового сульфата и λex 280 нм/λem 390nm для индоксилсульфата, индола-3-уксусной кислоты и внутреннего стандарта. Гиппурная кислота контролировали детектором УФ-Вис при 254 нм. Количественные результаты получаются и рассчитываются с точки зрения их концентраций (мг/л).

Фекальная микробиота профиль. Сбор образцов квалифицированные образцы стула квалифицированные образцы в стерильных замороженных пробирках субъектами и были немедленно транспортированы в лабораторию, где они хранились при 80 ° С для дальнейшего тестирования.

Экстракция ДНК и секвенирование геномной ДНК из фекальных образцов экстрагируется с использованием быстрого набора ДНК Qiagen (Qiagen) в соответствии с руководящими принципами производителя. Качество экстрагированной метагеномной ДНК оценивается через 1,0% электрофорез агарозного геля и спектрофотометрический анализ (измерение оптической плотности при соотношении 260/280 нм). Для извлеченной ДНК считается подходящей, концентрация должна превышать 20 нг/мкл, с соотношением 260/280 нм в диапазоне от 1,8 до 2,0. Переменная область 4 (V4) бактериального гена 16S рРНК амплифицируется посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с бактериальными/архейными праймерами 515F/806R, включая штрих -коды для идентификации образца [20]. Полученные ампликоны очищаются с использованием набора для экстракции GeneJet (Thermo Scientific) и количественно определяют с помощью набора для анализа дсдна QBIT DSDNA на флуорометре QUBIN 2.0 (QUBIT). Библиотеки секвенирования готовится с использованием подготовительного набора DNA DNA Nebnext® Ultra ™ для Illumina (NEB) после протокола производителя. Очищенные библиотеки определяются количественно, нормализованы, объединяются, а затем используются для генерации кластеров и секвенирования на платформе Illumina Hiseq 2500 для производства парных чтений 250 п.н.

Снятые считывания пары объединяются с использованием Flash v1.2.7 [21], а фильтрация качества выполняется с использованием трубопровода QIIME 1.7 со сценариями Python [22]. Химерные последовательности были удалены Uchime [23]. Обработанные чтения (эффективные теги) кластеризуются в операционные таксономические единицы (OTU) при идентификации последовательности 97% с использованием Uparse [24], а таксономическая классификация присваивается на основе базы данных SILVA [25]. Чтобы оценить филогенетические отношения различных OTU, выравнивание множественных последовательностей выполняется с использованием Pynast V1.2 [26] против базы данных SILVA, а филогенетическое дерево было построено с использованием Fasttree [27].

Альфа -разнообразие оценивается по видовым богатству с использованием индекса Chao1 на уровне OTU. Кривая разреженной фракции генерируется путем случайного выбора подмножества данных секвенирования из каждого образца, чтобы представлять количество наблюдаемых видов, и кривая накопления видов предназначена для того, чтобы показать возникновение новых OTU (виды) с непрерывной выборкой. Для бета-разнообразия расчеты и анализируются различия Брей-Куртиса на уровне OTU и анализируются с использованием веганского пакета [28]. Основной координатный анализ (PCOA) проводится на основе расстояний Bray-Curtis, и как взвешенные, так и невзвешенные параметры Unifrac [29] вычисляются через трубопровод QIIME. Неметрическое размерное масштабирование (NMDS) выполняется с использованием пакетов взвешенной корреляционной сети (WGCNA), STAT и GGPLOT2 в R путем преобразования матрицы расстояния взвешенных и невзвешенных параметров UNIFRAC в новый набор ортогональных оси. Все анализы проводятся с использованием собственных R-сценариев, если не указано иное.

Функциональный состав метагеном прогнозируется из данных 16S рРНК с использованием программного обеспечения PicRust со сценариями Python [30]. Предварительная таблица чисел копий генов для каждого семейства генов из секвенированных бактериальных и архаальных геномов, основанных на базе данных IMG [32], наряду с филогенетическим деревом из базы данных Greengenes [32], используется для прогнозирования содержания генов.