Associação entre composição da microbiota fecal, concentrações de metabólitos e níveis de sulfato de indoxil

Pacientes e desenho do estudo

Sessenta pacientes em HD serão inscritos, da unidade de diálise, divisão renal do Hospital Metroharbour de Tungs. O consentimento informado por escrito para participar do estudo é obtido de cada participante após ser informado sobre o desenho e os objetivos do estudo. O protocolo experimental enviará aos comitês éticos do IRB para aprovação. Os critérios de inclusão são de 18 a 80 anos e diagnosticados com o estágio V da CKD (atualmente recebendo tratamento com hemodiálise> 3 meses). Os critérios de exclusão incluíram mulheres grávidas ou de enfermagem; pacientes com transplante renal, infecções graves, doenças cardíacas graves e doenças hepáticas, malignidade, distúrbios autoimunes, desnutrição grave; consumiu qualquer tipo de probióticos pré-ou ou teve antibioticoterapia dentro de 1 mês após o início do estudo; diagnosticada síndrome do intestino irritável, doença de Crohn ou colite ulcerosa; Recebendo ou receberam radiação intestinal ou tiveram ressecção de grande intestino, os participantes receberão instruções alimentares e são incentivadas a manter a ingestão alimentar estável, que é quantificada por questionários nutricionais durante as entrevistas com os pacientes. Os questionários coletaram informações sobre o valor semanal e a frequência do consumo de alimentos e bebidas. Os dados sobre a composição de nutrientes dos diferentes alimentos são obtidos usando as tabelas do Instituto de Nutrição e Segurança Alimentar, Universidade Nacional de Taiwan.

As amostras de coleta, preparação e análise de amostras são coletadas separadamente de cada participante. As amostras de sangue são coletadas após um período de jejum de 8 a 12 horas, usando tubos de fluoreto de sódio e mantidos no gelo até a transferência para o laboratório de pesquisa. Uma vez lá, as amostras são centrifugadas a 3.000 × g por 15 minutos a 4 ° C. O soro é então transferido para tubos estéreis e armazenado a -20 ° C para análise futura.

Medimos os níveis séricos de acetato, propionato, butirato e valerado, juntamente com SCFAs de cadeia ramificada, como isobutirato e isovalerato. Esses perfis de metabolito são analisados ​​usando a espectrometria de massa de cromatografia líquida de desempenho ultrapernométrico (UPLC-MS). Em resumo, 100 μl de cada amostra de soro são misturados em microtubos de 1,5 mL com 20 mg de NaCl, 10 mg de ácido citric, 20 μl de HCl 1 M e 100 μl de butanol. A mistura é agitada por 2 minutos e depois centrifugada a 18.000 × g por 15 minutos. O sobrenadante resultante é transferido para microtubos frescos para análise.

Medição das toxinas urêmicas, medimos os níveis totais de toxina urêmica em vez de níveis livres. As concentrações de sulfato de iroxil total, p-cresilfato, ácido indol-3-acético (IAA) e ácido hipúrico são quantificados centralmente usando um método descrito anteriormente [19]. Resumidamente, para a competição de ligação, o soro de 200μl ao qual adicionamos 20 μL de 0,50 mm 1-naftalenesulfônico (padrão interno) foi misturado com o vórtice com 250μL de octanoato de sódio 0,24M (concorrente de ligação). Após a incubação à temperatura ambiente para 5mina, adicionamos 2 ml de frio a acetona a proteínas precipitadas. Após a mistura de vórtice e centrifugação a 4 ° C, 1860 × g por 20 min, o sobrenadante foi transferido para tubos de teste de vidro de 12 mm × 100 mm, GL 14 e diclorometano de 2 ml. Após a mistura de vórtice e centrifugando a 4 ° C, 1860 × g por 10min, 200μl da camada superior foram transferidos para frascos de amostradores de vidro, seguidos pela adição de 20μL de 1M de HCl e 15μL foi injetada no HPLC. A análise HPLC foi realizada em um Agilent 1100 Series LC (Santa Clara, CA) e o software Agilent Chemstations foram utilizados para a análise cromatográfica. A separação foi realizada em uma coluna Zorbax SB-C18 SOLV PLUS HPLC (5 μM, 3,0 mm × 150 mm). Em uma vazão de 0,6 ml/min. A fase móvel A é o ácido trifluoroacético a 0,2% na água Milli-Q e a Fase Mobile B é de 0,2% de ácido trifluoroacético em acetonitrila. O método analítico consiste em uma corrida isocrática com 92% de fase móvel A por 23 min. Cada execução analítica foi seguida por um gradiente de lavagem de 1,3 min a 100% B. A temperatura da coluna foi de 25 ° C, e a temperatura da bandeja automática foi de 6 ° C. Quantificamos os analitos usando o analito para a proporção de área de pico padrão em um detector de fluorescência de alto desempenho Agilent 1100 G1321A e detectores UV-visíveis da série Agilent 1100 G1314A. As configurações do detector foram λex 260 nm/λem288nm para p-cresilsilfato e λex 280 nm/λem 390nm para sulfato de indoxil, ácido indol-3-acético e padrão interno. O ácido hipúrico foi monitorado pelo detector UV-vis a 254 nm. Os resultados quantitativos são obtidos e calculados em termos de suas concentrações (Mg/L).

A amostra de amostra de perfil de microbiota fecal amostras de fezes qualificadas são auto -coletadas em tubos congelados estéreis por indivíduos e foram transportados imediatamente para o laboratório onde foram armazenados a - 80 ° C para testes adicionais.

A extração de DNA e o DNA genômico de sequenciamento de amostras fecais são extraídos usando o kit rápido do DNA Qiagen (Qiagen) de acordo com as diretrizes do fabricante. A qualidade do DNA metagenômico extraída é avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1,0% e análise espectrofotométrica (medindo a densidade óptica na proporção de 260/280 nm). Para que o DNA extraído seja considerado adequado, a concentração deve exceder 20 ng/μl, com uma proporção de 260/280 nm na faixa de 1,8 a 2,0. A região variável 4 (V4) do gene bacteriana 16S rRNA é amplificada através da reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores bacterianos/archaeais 515F/806R, incluindo códigos de barras para identificação da amostra [20]. Os amplicons resultantes são purificados usando o kit de extração de gel de genejet (Thermo Scientific) e quantificados com um kit de ensaio qubit dsDNA HS em um fluorômetro Qubit 2.0 (qubit). As bibliotecas de seqüenciamento são preparadas usando o Kit Prep NebNext® Ultra ™ DNA Library Prep for Illumina (NEB), seguindo o protocolo do fabricante. As bibliotecas purificadas são quantificadas, normalizadas, agrupadas e depois usam para geração de cluster e sequenciamento em uma plataforma Illumina Hisseq 2500 para produzir leituras de ponta emparelhadas de 250 pb.

As leituras de extremidade pareada são mescladas usando o flash v1.2.7 [21] e a filtragem de qualidade é realizada usando o qiime 1.7 pipeline com scripts Python [22]. As sequências quiméricas foram removidas por Uchime [23]. As leituras processadas (tags eficazes) estão agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com identidade de sequência de 97% usando UPARSE [24], e a classificação taxonômica é atribuída com base no banco de dados SILVA [25]. Para avaliar as relações filogenéticas de diferentes OTUs, vários alinhamentos de sequência são realizados usando o Pynost V1.2 [26] contra o banco de dados SILVA, e uma árvore filogenética foi construída usando o FastTree [27].

A diversidade alfa é estimada pela riqueza de espécies usando o índice Chao1 no nível da OTU. Uma curva de rarefação é gerada selecionando aleatoriamente um subconjunto de dados de sequenciamento de cada amostra para representar o número de espécies observadas, e uma curva de acumulação de espécies é plotada para mostrar a ocorrência de novas OTUs (espécies) com amostragem contínua. Para a diversidade beta, as dissimilaridades de Bray-Curtis no nível OTU são calculadas e analisadas usando o pacote vegano [28]. A análise de coordenadas principais (PCOA) é realizada com base nas distâncias de Bray-Curtis, e os parâmetros UNIFRAC ponderados e não ponderados [29] são calculados através do pipeline Qiime. A escala dimensional não-metric (NMDS) é realizada usando os pacotes de rede de correlação ponderada (WGCNA), Pacotes STAT e GGPLOT2 em R, transformando uma matriz de distância de parâmetros unifrac ponderados e não ponderados em um novo conjunto de eixos ortogonais. Todas as análises são realizadas usando scripts R internos, a menos que especificado de outra forma.

A composição funcional dos metagenomas é prevista a partir de dados de 16S rRNA usando o software Picrust com scripts Python [30]. Uma tabela pré -computada de números de cópias de genes para cada família de genes de genomas bacterianos e archaeais sequenciados, com base no banco de dados IMG [32], juntamente com uma árvore filogenética do banco de dados Greengenes [32], é usada para previsão de conteúdo de genes.