Związek między składem mikroflory kałowej, stężeniem metabolitu i poziomem indoksylu siarczanu

Pacjenci i projekt badań

Sześćdziesięciu pacjentów z HD zostanie zapisanych z jednostki dializy, podziału nerek szpitala Metroharbour Tungs 'Hospital. Pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu jest uzyskiwana od każdego uczestnika po tym, jak został poinformowany o projekcie badań i celach. Protokół eksperymentalny wyśle ​​do zatwierdzenia do komitetów etycznych IRB. Kryteria włączenia wynoszą 18-80 lat i zdiagnozowano w stadium V CKD (obecnie otrzymując leczenie hemodializy> 3 miesiące). Kryteria wykluczenia obejmowały kobiety w ciąży lub pielęgniarce; Pacjenci z przeszczepem nerki, ciężkie infekcje, ciężkie choroby serca i choroby wątroby, nowotwory, zaburzenia autoimmunologiczne, ciężkie niedożywienie; spożywał jakikolwiek rodzaj probiotyków lub miało antybiotykoterapię w ciągu 1 miesiąca od rozpoczęcia badania; Zdiagnozowano zespół jelita drażliwego, chorobę Crohna lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego; Otrzymanie lub otrzymanie promieniowania jelit lub mieli resekcję jelit dla dużych jelita, uczestnicy otrzymają instrukcje dietetyczne i są zachęcani do utrzymania stabilnego spożycia diety, co jest określone ilościowo przez kwestionariusze żywieniowe podczas wywiadów pacjentów. Kwestionariusze zebrały informacje o tygodniowej ilości i częstotliwości spożycia żywności i napojów. Dane dotyczące składu składników odżywczych różnych pokarmów są uzyskiwane przy użyciu tabel Institute of Nutrition and Food Safety, National Taiwan University.

Zbieranie próbek, przygotowanie i analiza próbki krwi są zbierane osobno od każdego uczestnika. Próbki krwi są zbierane po 8 do 12-godzinnym okresie postu, stosując rurki fluorkowe sodu, i utrzymuje się na lodzie aż do przeniesienia do laboratorium badawczego. Tam próbki wirowane są przy 3000 x g przez 15 minut w 4 ° C. Surowica jest następnie przenoszona do sterylnych rur i przechowywana w temperaturze -20 ° C do przyszłej analizy.

Mierzymy poziomy octanu, propionianu i waletowania w surowicy, wraz z SCF rozgałęzionym łańcuchem, takimi jak izobutyran i izowalerian. Te profile metabolitów są analizowane przy użyciu ultraperformance cieczowej spektrometrii chromatografii cieczowej (UPLC-MS). W skrócie, 100 μl każdej próbki surowicy miesza się w mikrotubach 1,5 ml z 20 mg NaCl, 10 mg kwasu cytrynowego, 20 μl 1 M HCl i 100 μl butanolu. Mieszaninę jest wirowy przez 2 minuty, a następnie wirowane przy 18 000 x g przez 15 minut. Powstały supernatant jest przenoszony do świeżych mikrotubów do analizy.

Pomiar toksyn moczkowych mierzymy całkowity poziom toksyn moczniczy, a nie poziomy wolne. Stężenia całkowitego siarczanu indoksylu, siarczanu p-krezylu, kwasu indol-3-octowego (IAA) i kwasu hippurowego są centralnie określone ilościowo przy użyciu wcześniej opisanej metody [19]. W skrócie, do konkurencji wiązania, 200 μl surowicy, do której dodaliśmy 20 μl 0,50 mm 1 naftalenosulfonu (wewnętrzny standard) mieszano wir z 250 μl 0,24 M oktanoanu sodu (konkurenta wiążącego). Po inkubacji w temperaturze pokojowej dla 5 minut, dodaliśmy 2ml octon zimny do wytrącania białek. Po mieszaniu wiru i wirowaniu przy 4 ° C, 1860 × g przez 20 minut, dodano supernatant do 12 mm x 100 mm, GL 14 szklanych szklanych rur i 2 ml dichlorometanu. Po mieszaniu wiru i odwirowaniu przy 4 ° C, 1860 x g dla 10 minut, 200 μl górnej warstwy przeniesiono do szklanych fiolek autosamplera, a następnie dodano 20 μl 1M HCl i 15 μl wstrzyknięto na HPLC. Analizę HPLC przeprowadzono na analizie chromatograficznej Agilent 1100 Series LC (Santa Clara, Kalifornia), a oprogramowanie Agilent Chemstations zastosowano. Separacja przeprowadzono na kolumnie Zorbax SB-C18 Solv Plus HPLC (5 μM, 3,0 mm × 150 mm). AT A Szybkość przepływu 0,6 ml/min. Faza mobilna A wynosi 0,2% kwas trifluorooctowy w wodzie Milli-Q, a faza mobilna B wynosi 0,2% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu. Metoda analityczna składa się z izokratycznego przebiegu z 92% fazą mobilną A przez 23 min. Po każdym przebiegu analitycznym nastąpił gradient wymywania 1,3 min do 100% B. Temperatura kolumny wynosiła 25 ° C, a temperatura tacy autosamplerowej wynosiła 6 ◦C. Kwantyfikowaliśmy anality przy użyciu analitu do standardowego stosunku powierzchni piku na detektorze Fluorescencji Agilent 1100 G1321A i detektorów UV widzialnych w serii Agilent 1100 G1314A. Ustawienia detektora były λex 260 nm/λEM288NM dla p-krezylu siarczanu i λex 280 nm/λem 390 nm dla siarczanu indoksylu, kwasu indol-3-octowego i wewnętrznego standardu. Kwas hippurowy monitorowano przez detektor UV-VIS przy 254 nm. Wyniki ilościowe są uzyskiwane i obliczane pod względem ich stężeń (Mg/L).

Kwalifikowane próbki stolca Profil kale z mikroflory są samodzielnie gromadzone w sterylnych zamrożonych probówkach przez pacjentów i zostały przetransportowane natychmiast do laboratorium, gdzie były przechowywane na poziomie - 80 ° C w celu dalszych testów.

Ekstrakcja DNA i sekwencjonowanie genomowego DNA z próbek kału jest ekstrahowane przy użyciu szybkiego zestawu Studego DNA Qiagen (Qiagen) zgodnie z wytycznymi producenta. Jakość ekstrahowanego metagenomicznego DNA ocenia się za pomocą 1,0% elektroforezy żelu agarozowego i analizy spektrofotometrycznej (mierząc gęstość optyczną przy stosunku 260/280 nm). Aby ekstrahowany DNA został uznany za odpowiednie, stężenie musi przekraczać 20 ng/μl, przy stosunku 260/280 nm w zakresie 1,8 do 2,0. Zmienny region 4 (V4) genu rRNA bakteryjnego 16S jest amplifikowany poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z starterami bakteryjnymi/archeologicznymi 515F/806R, w tym kody kreskowe do identyfikacji próbki [20]. Powstałe amplikony są oczyszczane przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelu genejtowego (Thermo Scientific) i ilościowo kwantycznie za pomocą zestawu testu HS HS Qubit DsDNA na fluorometrze Qubit 2.0 (Qubit). Biblioteki sekwencjonowania są przygotowywane przy użyciu zestawu do biblioteki NEBNEXT® ULTRA ™ DNA Prep dla Illumina (NEB), zgodnie z protokołem producenta. Oczyszczone biblioteki są określane ilościowo, znormalizowane, łączone, a następnie użyte do generowania klastrów i sekwencjonowania na platformie Illumina Hiseq 2500 do wytworzenia odczytów sparowanych na poziomie 250 pz.

Odczyty z ciąży sparowanej są scalane za pomocą Flash V1.2.7 [21], a filtrowanie jakości wykonuje się za pomocą rurociągu QIIME 1.7 z skryptami Python [22]. Sekwencje chimeryczne usunięto przez Uchime [23]. Przetworzone odczyty (efektywne znaczniki) są skupione w operacyjnych jednostkach taksonomicznych (OTUS) przy 97% tożsamości sekwencji za pomocą UPARSE [24], a klasyfikację taksonomiczną jest przypisywana na podstawie bazy danych Silva [25]. Aby ocenić relacje filogenetyczne różnych OTU, wiele wyrównania sekwencji przeprowadza się przy użyciu Pynast V1.2 [26] w stosunku do bazy danych Silva i zbudowano drzewo filogenetyczne przy użyciu FastTree [27].

Różnorodność alfa jest szacowana przez bogactwo gatunków przy użyciu wskaźnika ChAO1 na poziomie OTU. Krzywa rozrzedzania jest generowana przez losowe wybór podzbioru danych sekwencjonowania z każdej próbki w celu przedstawienia liczby obserwowanych gatunków, a krzywa akumulacji gatunków jest wykreślona w celu wykazania występowania nowych OTU (gatunków) z ciągłym pobieraniem próbek. W przypadku różnorodności beta odmienności Bray-Curtis na poziomie OTU są obliczane i analizowane przy użyciu pakietu wegańskiego [28]. Analiza współrzędnych głównych (PCOA) jest przeprowadzana na podstawie odległości Bray-Curtis, a zarówno ważone, jak i nieważone parametry UniFRAC [29] są obliczane za pośrednictwem rurociągu QIIME. Niemetryczne skalowanie wymiarowe (NMDS) jest wykonywane przy użyciu pakietów ważonej sieci korelacji (WGCNA), STAT i GGPLOT2 w R poprzez przekształcenie macierzy odległości ważonych i nieważonych parametrów UniFRAC w nowy zestaw osi ortogonalnych. Wszystkie analizy są przeprowadzane przy użyciu wewnętrznych skryptów R, chyba że określono inaczej.

Skład funkcjonalny metagenomów jest przewidywany na podstawie danych 16S RRNA przy użyciu oprogramowania Picrust z skryptami Python [30]. Wstępna tabela liczb kopii genów dla każdej rodziny genów z sekwencjonowanych genomów bakteryjnych i archeologicznych, oparta na bazie danych IMG [32], wraz z drzewem filogenetycznym z bazy danych Greengenes [32], jest używana do przewidywania zawartości genów.