Associazione tra composizione del microbiota fecale, concentrazioni di metaboliti e livelli di indoxil solfato

Pazienti e progettazione dello studio

Sessanta pazienti HD saranno arruolati, dall'unità di dialisi, divisione renale dell'ospedale Taichung Metroharbour dei Tungs. Il consenso informato scritto per prendere parte allo studio è ottenuto da ciascun partecipante dopo essere stato informato sulla progettazione e gli obiettivi dello studio. Il protocollo sperimentale invierà ai comitati etici dell'IRB per l'approvazione. I criteri di inclusione sono di età compresa tra 18 e 80 anni e sono diagnosticati con CKD Stage V (attualmente ricevendo il trattamento dell'emodialisi> 3 mesi). I criteri di esclusione includevano donne in gravidanza o infermieristiche; pazienti con trapianto di rene, infezioni gravi, malattie cardiache gravi e malattie epatiche, malignità, disturbi autoimmuni, grave malnutrizione; consumato qualsiasi tipo di pre-o probiotici o aveva una terapia antibiotica entro 1 mese dall'inizio dello studio; Sindrome intestinale irritabile diagnosticata, malattia di Crohn o colite ulcerosa; Ricezione o hanno ricevuto radiazioni intestinali o hanno avuto una grande resezione intestinale, i partecipanti riceveranno istruzioni dietetiche e sono incoraggiati a mantenere un apporto dietetico stabile, che è quantificato da questionari nutrizionali durante le interviste con i pazienti. I questionari hanno raccolto informazioni sulla quantità settimanale e la frequenza del consumo di cibo e bevande. I dati relativi alla composizione nutrizionale dei diversi alimenti sono ottenuti utilizzando le tabelle dell'Istituto di nutrizione e sicurezza alimentare, National Taiwan University.

I campioni di sangue di raccolta, preparazione e analisi vengono raccolti separatamente da ciascun partecipante. I campioni di sangue vengono raccolti dopo un periodo di digiuno da 8 a 12 ore, usando tubi di fluoro di sodio e mantenuti sul ghiaccio fino al trasferimento al laboratorio di ricerca. Una volta lì, i campioni sono centrifugati a 3.000 × g per 15 minuti a 4 ° C. Il siero viene quindi trasferito su tubi sterili e conservato a -20 ° C per analisi future.

Misuriamo i livelli sierici di acetato, propionato, butirrato e valerano, insieme a SCFA a catena ramificata come isobutirrato e isovalerate. Questi profili di metaboliti vengono analizzati utilizzando la spettrometria a massa di cromatografia liquida ultraperformance (UPLC-MS). In breve, 100 μL di ciascun campione sierico vengono miscelati in microtubi da 1,5 ml con 20 mg di NaCl, 10 mg di acido citrico, 20 μL di HCl da 1 m e 100 μL di butanolo. La miscela viene vortici per 2 minuti e quindi centrifugata a 18.000 × g per 15 minuti. Il surnatante risultante viene trasferito in microtubi freschi per l'analisi.

Misurazione delle tossine uremiche misuriamo i livelli totali di tossina uremica piuttosto che i livelli liberi. Le concentrazioni di indoxil solfato totale, p-cresil solfato, acido indolo-3-acetico (IAA) e acido ippurico sono quantificate centralmente usando un metodo precedentemente descritto [19]. In breve, per la competizione di legame, 200 μl di siero a cui abbiamo aggiunto acido da 20 μl da 0,50 mm 1-naftalenesulfonico (standard interno) è stato miscelato con vortice con ottanoato di sodio da 250 μl 0,24 m (concorrente legante). Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti, abbiamo aggiunto 2ml acetone freddo per le proteine ​​precipita. Dopo il mix di vortice e la centrifugazione a 4 ° C, 1860 × g per 20 minuti, il surnatante è stato trasferito a 12 mm × 100 mm, sono stati aggiunti tubi di prova di vetro GL 14 e 2 ml di diclorometano. Dopo il mix di vortice e la centrifugazione a 4 ° C, 1860 × g per 10 minuti, 200 μl dello strato superiore sono stati trasferiti su fiale di autocampionamento in vetro, seguite da un'aggiunta di 20 μl di HCl 1M e 15 μL sono stati iniettati nell'HPLC. L'analisi HPLC è stata eseguita su un Agilent 1100 Series LC (Santa Clara, CA) e il software Agilent ChemStations sono stati utilizzati per l'analisi cromatografica. La separazione è stata effettuata su una colonna HPLC Zorbax SB-C18 Solv Plus (5 μm, 3,0 mm × 150 mm). Con una portata di 0,6 mL/min. La fase A mobile è l'acido trifluoroacetico dello 0,2% in acqua mille-Q e la fase mobile B è acido trifluoroacetico allo 0,2% in acetonitrile. Il metodo analitico è costituito da una corsa isocratica con fase mobile A al 92% per 23 minuti. Ogni esecuzione analitica è stata seguita da un gradiente di lavaggio di 1,3 minuti al 100% di B. La temperatura della colonna era di 25 ° C e la temperatura del vassoio automatico era di 6 ° C. Abbiamo quantificato gli analiti utilizzando il rapporto di area di picco analiti a standard su un rivelatore di fluorescenza ad alte prestazioni Agilent 1100 G1321A e rivelatori UV-Visibili della serie Agilent 1100 G1314A. Le impostazioni del rivelatore erano λex 260 nm/λem288nm per p-cresil solfato e λex 280 nm/λem 390nm per indoxil solfato, acido indolo-3-acetico e standard interno. L'acido ippurico è stato monitorato dal rivelatore UV-Vis a 254 nm. I risultati quantitativi sono ottenuti e calcolati in termini di concentrazioni (mg/L).

Raccolta di campioni di campioni di campioni di microbiota fecale I campioni di feci qualificati sono auto -raccolti in tubi congelati sterili da parte di soggetti e sono stati trasportati immediatamente in laboratorio dove sono stati conservati a - 80 ° C per ulteriori test.

L'estrazione del DNA e il sequenziamento del DNA genomico da campioni fecali vengono estratti utilizzando il kit Fast (Qiagen) del DNA Qiagen DNA (Qiagen) secondo le linee guida del produttore. La qualità del DNA metagenomico estratto viene valutata attraverso l'elettroforesi su gel di agarosio all'1,0% e l'analisi spettrofotometrica (misurando la densità ottica con un rapporto di 260/280 nm). Affinché il DNA estratto sia considerato adatto, la concentrazione deve superare i 20 ng/μl, con un rapporto di 260/280 nm nell'intervallo da 1,8 a 2,0. La regione variabile 4 (V4) del gene rRNA 16S batterico viene amplificata attraverso la reazione a catena della polimerasi (PCR) con primer batterici/arcaici 515F/806R, compresi i codici a barre per l'identificazione del campione [20]. Gli ampliconi risultanti vengono purificati usando il kit di estrazione di gel Genejet (Thermo Scientific) e quantificati con un kit di dosaggio DSDNA HS Qubit su un fluorometro Qubit 2.0 (Qubit). Le librerie di sequenziamento vengono preparate utilizzando il kit di preparazione della libreria DNA NEBNEXT® ULTRA ™ per Illumina (NEB), seguendo il protocollo del produttore. Le librerie purificate sono quantificate, normalizzate, raggruppate e quindi utilizzate per la generazione di cluster e il sequenziamento su una piattaforma Illumina Hiseq 2500 per produrre letture di fine end da 250 bp.

Le letture di fascia abbinata vengono unite utilizzando Flash v1.2.7 [21] e il filtro di qualità viene eseguito utilizzando la pipeline Qiime 1.7 con script Python [22]. Le sequenze chimeriche sono state rimosse da Uchime [23]. Le letture elaborate (tag efficaci) sono raggruppate in unità tassonomiche operative (OTUS) con identità di sequenza del 97% usando Uparse [24] e la classificazione tassonomica è assegnata in base al database SILVA [25]. Per valutare le relazioni filogenetiche di OTU diversi, vengono eseguiti allineamenti a sequenze multiple utilizzando Pynast V1.2 [26] rispetto al database SILVA e un albero filogenetico è stato costruito usando FastTree [27].

La diversità alfa è stimata dalla ricchezza delle specie usando l'indice ChaO1 a livello di OTU. Una curva di rarefazione viene generata selezionando in modo casuale un sottoinsieme di dati di sequenziamento da ciascun campione per rappresentare il numero di specie osservate e viene tracciata una curva di accumulo di specie per mostrare la presenza di nuovi OTU (specie) con campionamento continuo. Per la diversità beta, le difficoltà di Bray-Curtis a livello di OTU vengono calcolate e analizzate usando il pacchetto vegano [28]. L'analisi delle coordinate principali (PCOA) è condotta sulla base delle distanze di Bray-Curtis e i parametri unifrac ponderati e non ponderati [29] vengono calcolati attraverso la pipeline Qiime. Il ridimensionamento dimensionale non metrico (NMDS) viene eseguito utilizzando l'analisi della rete di correlazione ponderata (WGCNA), i pacchetti STAT e GGPlot2 in R trasformando una matrice di distanza di parametri unifrac ponderati e non ponderati in una nuova serie di assi ortogonali. Tutte le analisi vengono condotte utilizzando script R interni, se non diversamente specificato.

La composizione funzionale dei metagenomi è prevista dai dati di rRNA 16S utilizzando il software Picrust con script Python [30]. Una tabella precomputata di numeri di copia genica per ciascuna famiglia genica da genomi batterici e arcaici sequenziati, basato sul database IMG [32], insieme a un albero filogenetico del database Greengenes [32], viene utilizzata per la previsione del contenuto genico.