Association entre la composition du microbiote fécal, les concentrations de métabolites et les niveaux de sulfate d'indoxyle

Patients et conception d'étude

Soixante patients HD seront inscrits, de l'unité de dialyse, division rénale de l'hôpital de Metroharbour Tauchung des Tungs. Le consentement éclairé écrit pour participer à l'étude est obtenu de chaque participant après avoir été informé de la conception et des objectifs de l'étude. Le protocole expérimental enverra les comités éthiques de la CISR pour approbation. Les critères d'inclusion sont âgés de 18 à 80 ans et diagnostiqués avec CKD stade V (recevant actuellement un traitement à l'hémodialyse> 3 mois). Les critères d'exclusion comprenaient des femmes enceintes ou en soins qui allaitent; les patients atteints de transplantation rénale, d'infections graves, de maladies cardiaques graves et de maladies hépatiques, de tumeurs malignes, de troubles auto-immunes, de malnutrition sévère; consommé tout type de probiotique pré ou présentant une antibiothérapie dans le mois suivant le début de l'étude; Syndrome du côlon irritable diagnostiqué, la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse; recevoir ou avoir reçu des rayonnements intestinaux ou subi une résection intestinale importante Les participants recevront des instructions alimentaires et sont encouragés à maintenir une apport alimentaire stable, qui est quantifié par des questionnaires nutritionnels lors des entretiens avec les patients. Les questionnaires ont recueilli des informations sur la quantité hebdomadaire et la fréquence de la consommation alimentaire et des boissons. Les données concernant la composition en nutriments des différents aliments sont obtenues à l'aide des tableaux de l'Institut de nutrition et de sécurité alimentaire, Université nationale de Taïwan.

Les échantillons de sang de collecte, de préparation et d'analyse des échantillons sont prélevés séparément de chaque participant. Les échantillons de sang sont prélevés après une période de jeûne de 8 à 12 heures, à l'aide de tubes de fluorure de sodium, et maintenus sur la glace jusqu'à transfert au laboratoire de recherche. Une fois sur place, les échantillons sont centrifugés à 3 000 × g pendant 15 minutes à 4 ° C. Le sérum est ensuite transféré dans des tubes stériles et stocké à -20 ° C pour une analyse future.

Nous mesurons les taux sériques d'acétate, de propionate, de butyrate et de validation, ainsi que des SCFA à chaîne ramifiée tels que l'isobutyrate et l'isovalerate. Ces profils de métabolites sont analysés en utilisant la spectrométrie de masse liquide ultraperformance (UPLC-MS). En bref, 100 μL de chaque échantillon sérique sont mélangés dans des microtubes de 1,5 ml avec 20 mg de NaCl, 10 mg d'acide citrique, 20 μl de HCl 1 m et 100 μl de butanol. Le mélange est vortexé pendant 2 minutes puis centrifugé à 18 000 x g pendant 15 minutes. Le surnageant résultant est transféré dans des microtubes frais pour analyse.

Mesure des toxines urémiques Nous mesurons les niveaux totaux de toxines urémiques plutôt que des niveaux libres. Les concentrations de sulfate d'indoxyle total, de sulfate de p -ésyle, d'acide indole-3-acétique (IAA) et d'acide hippurique sont quantifiées centralement en utilisant une méthode décrite précédemment [19]. En bref, pour la compétition de liaison, 200 μl de sérum auquel nous avons ajouté 20 μl d'acide 1-naphtalènesulfonique de 20 mm (standard interne) a été mélangé au vortex avec 250 μl d'octanoate de sodium 0,24 m (concurrent de liaison). Après une incubation à la température ambiante pendant 5 minutes, nous avons ajouté 2 ml d'acétone froide aux protéines précipitantes. Après le mixage du vortex et le centrifugation à 4 ◦C, 1860 × g pendant 20 min, le surnageant a été transféré à des tubes à essai en verre de 12 mm × 100 mm, et du dichlorométhane de 2 ml. Après mixage du vortex et centrifugation à 4 ◦C, 1860 × g pendant 10 minutes, 200 μl de la couche supérieure ont été transférés sur des flacons d'échantillonneur de automatique en verre, suivi de l'addition de 20 μl de HCl 1M et de 15 μl ont été injectés sur le HPLC. L'analyse HPLC a été réalisée sur un Agilent 1100 Series LC (Santa Clara, CA) et le logiciel Agilent ChemStations a été utilisé pour l'analyse chromatographique. La séparation a été réalisée sur une colonne SoLV Solv plus Zorbax SB-C18 plus HPLC (5 μm, 3,0 mm × 150 mm). À un débit de 0,6 ml / min. La phase mobile A est de 0,2% de l'acide trifluoroacétique dans l'eau Milli-Q et la phase mobile B est de 0,2% d'acide trifluoroacétique dans l'acétonitrile. La méthode analytique se compose d'une course isocratique avec une phase mobile A à 92% pendant 23 min. Chaque exécution analytique a été suivie d'un gradient de lavage de 1,3 min à 100% B. La température de la colonne était de 25 ° C et la température du plateau de l'échantillonneur automatique était de 6 ° C. Nous avons quantifié les analytes en utilisant le rapport analyte de pic standard sur un détecteur de fluorescence à haute performance Agilent 1100 G1321A et des détecteurs UV-visibles UV-visibles de la série Agilent 1100 G1314A. Les réglages du détecteur étaient λEx 260 nm / λem288 nm pour le sulfate de p -ésyle et le λex 280 nm / λem 390 nm pour le sulfate indoxyle, l'acide indole-3-acétique et la norme interne. L'acide hippurique a été surveillé par détecteur UV-Vis à 254 nm. Les résultats quantitatifs sont obtenus et calculés en termes de leurs concentrations (mg / L).

Échantillon d'échantillons d'échantillons de profil de microbiote fécal sont auto-collectés dans des tubes congelés stériles par des sujets et ont été transportés immédiatement au laboratoire où ils ont été stockés à - 80 ° C pour d'autres tests.

Extraction d'ADN et séquençage de l'ADN génomique à partir d'échantillons fécaux est extrait à l'aide du kit de jeûne de selles d'ADN Qiagen (Qiagen) selon les directives du fabricant. La qualité de l'ADN métagénomique extrait est évaluée par une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,0% et une analyse spectrophotométrique (mesurer la densité optique à un rapport 260/280 nm). Pour que l'ADN extrait soit considéré comme approprié, la concentration doit dépasser 20 ng / μl, avec un rapport 260/280 nm dans la plage de 1,8 à 2,0. La région variable 4 (V4) du gène de l'ARNr bactérien 16S est amplifiée par réaction en chaîne par polymérase (PCR) avec des amorces bactériennes / archéennes 515F / 806R, y compris les codes de bar pour l'identification de l'échantillon [20]. Les amplicons résultants sont purifiés à l'aide du kit d'extraction de gel GeneJet (Thermo Scientific) et quantifiés avec un kit de dosage DSDNA HS Qubit sur un fluoromètre Qubit 2.0 (Qubit). Les bibliothèques de séquençage sont préparées à l'aide du kit de préparation à la bibliothèque ADN Nebnext® Ultra ™ pour Illumina (NEB), suivant le protocole du fabricant. Les bibliothèques purifiées sont quantifiées, normalisées, regroupées, puis utilisent pour la génération de grappes et le séquençage sur une plate-forme Illumina Hiseq 2500 pour produire des lectures de 250 pb.

Les lectures à extrémité appariée sont fusionnées à l'aide de Flash V1.2.7 [21], et le filtrage de qualité est effectué à l'aide du pipeline Qiime 1.7 avec des scripts Python [22]. Les séquences chimériques ont été supprimées par uchime [23]. Les lectures traitées (balises effectives) sont regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) à 97% d'identité de séquence à l'aide de UPARSE [24], et la classification taxonomique est attribuée sur la base de la base de données Silva [25]. Pour évaluer les relations phylogénétiques de différents OTU, plusieurs alignements de séquence sont effectués en utilisant Pynast V1.2 [26] contre la base de données Silva, et un arbre phylogénétique a été construit à l'aide de FastTree [27].

La diversité alpha est estimée par la richesse en espèces en utilisant l'indice CHAO1 au niveau OTU. Une courbe de raréfaction est générée en sélectionnant au hasard un sous-ensemble de données de séquençage de chaque échantillon pour représenter le nombre d'espèces observées, et une courbe d'accumulation d'espèces est tracée pour montrer la survenue de nouveaux OTU (espèces) avec un échantillonnage continu. Pour la diversité bêta, les dissemblances de Bray-Curtis au niveau OTU sont calculées et analysées à l'aide du package végétalien [28]. L'analyse des coordonnées principales (PCOA) est réalisée sur la base des distances de Bray-Curtis, et les paramètres UNIFRAC pondérés et non pondérés [29] sont calculés via le pipeline Qiime. La mise à l'échelle dimensionnelle non métrique (NMDS) est réalisée en utilisant les packages d'analyse de réseau de corrélation pondérés (WGCNA), STAT et GGPLOT2 en R en transformant une matrice de distance de paramètres UNIFRAC pondérés et non pondérés en un nouvel ensemble d'axes orthogonaux. Toutes les analyses sont effectuées à l'aide de scripts en interne, sauf indication contraire.

La composition fonctionnelle des métagénomes est prédite à partir des données d'ARNr 16S à l'aide du logiciel PICRUST avec des scripts Python [30]. Un tableau pré-composé des nombres de copies de gènes pour chaque famille de gènes à partir de génomes bactériens et archéo-archéens séquencés, basé sur la base de données IMG [32], ainsi qu'un arbre phylogénétique de la base de données Greengenes [32], est utilisé pour la prédiction du contenu des gènes.