Forbindelse mellem fækal mikrobiota -sammensætning, metabolitkoncentrationer og indoxylsulfatniveauer

Patienter og studiedesign

60 HD -patienter vil blive tilmeldt fra Dialyse -enhed, nyreafdeling i Tungs 'Taichung Metroharbour Hospital. Det skriftlige informerede samtykke til at deltage i undersøgelsen opnås fra hver deltager efter at have været informeret om studiedesign og mål. Den eksperimentelle protokol vil sende til de etiske udvalg i IRB til godkendelse. Inkluderingskriterier er 18-80 år i alderen og diagnosticeret med CKD-trin V (modtager i øjeblikket hæmodialysebehandling> 3 måneder). Ekskluderingskriterier inkluderede gravide eller ammende kvinder; Patienter med nyretransplantation, alvorlige infektioner, alvorlige hjertesygdomme og leversygdomme, malignitet, autoimmune lidelser, alvorlig underernæring; forbrugte enhver form for pre-or probiotika eller havde antibiotikabehandling inden for 1 måned efter påbegyndelse; diagnosticeret irritabelt tarmsyndrom, Crohns sygdom eller ulcerøs colitis; Modtagelse eller har modtaget tarmstråling eller haft stor tarmresektion, som deltagerne vil modtage diætinstruktioner og opfordres til at opretholde et stabilt diætindtag, som kvantificeres ved ernæringsspørgeskemaer under patientinterviews. Spørgeskemaerne indsamlede oplysninger om det ugentlige beløb og hyppigheden af ​​forbrug af mad og drikkevarer. Data vedrørende næringssammensætningen af ​​de forskellige fødevarer opnås ved hjælp af tabellerne fra Institute of Nutrition and Food Safety, National Taiwan University.

Prøvesamling, forberedelse og analyse Blodprøver indsamles separat fra hver deltager. Blodprøver opsamles efter en 8 til 12-timers faste periode ved hjælp af natriumfluoridrør og holdes på is, indtil den overføres til forskningslaboratoriet. Når prøverne er der, er prøverne centrifugeret ved 3.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Serumet overføres derefter til sterile rør og opbevares ved -20 ° C til fremtidig analyse.

Vi måler serumniveauer af acetat, propionat, butyrat og valerat sammen med forgrenede SCFA'er, såsom isobutyrat og isovalerat. Disse metabolitprofiler analyseres ved anvendelse af ultraperformance væskekromatografimassespektrometri (UPLC-MS). Kort fortalt blandes 100 μL af hver serumprøve i 1,5 ml mikrotubes med 20 mg NaCI, 10 mg citronsyre, 20 μl 1 M HCI og 100 μl butanol. Blandingen er hvirvlet i 2 minutter og centrifugeres derefter ved 18.000 x g i 15 minutter. Den resulterende supernatant overføres til friske mikrotuber til analyse.

Måling af uremiske toksiner måler vi samlede uremiske toksinniveauer snarere end frie niveauer. Koncentrationerne af total indoxylsulfat, p-cresylsulfat, indol-3-eddikesyre (IAA) og hippursyre kvantificeres centralt ved anvendelse af en tidligere beskrevet metode [19]. Kort fortalt, til bindingskonkurrence, blev 200 μl serum, som vi tilsatte 20μL 0,50 mm 1-naphthalenesulfonsyre (intern standard), hvirvlet blandet med 250 μl 0,24 m natriumoktanoat (bindende konkurrent). Efter inkubation ved stuetemperatur i 5 minutter tilføjede vi 2 ml kold acetone til præcipitatproteiner. Efter hvirvelblanding og centrifugering ved 4 ◦C, 1860 × g i 20 minutter blev supernatanten overført til 12 mm × 100 mm, GL 14 glas testrør og 2 ml dichlormethan blev tilsat. Efter hvirvelblanding og centrifugering ved 4 ◦C blev 1860 × g i 10 minutter, 200 μl af det øverste lag overført til glas autosampler hætteglas, efterfulgt af tilsætning af 20 μl 1M HCI og 15 μl blev injiceret på HPLC. HPLC -analysen blev udført på en Agilent 1100 -serie LC (Santa Clara, CA), og Agilent Chemstations -software blev anvendt til den kromatografiske analyse. Adskillelsen blev udført på en Zorbax SB-C18 Solv Saver plus HPLC-søjle (5 um, 3,0 mm × 150 mm). I en strømningshastighed på 0,6 ml/min. Mobil fase A er 0,2% trifluoreddikesyre i Milli-Q vand og mobil fase B er 0,2% trifluoreddikesyre i acetonitril. Den analytiske metode består af et isokratisk løb med 92% mobil fase A i 23 minutter .. Hver analytisk kørsel blev efterfulgt af en 1,3 min. Udvaskningsgradient til 100% B. Søjttemperatur var 25 ◦C, og Autosampler -bakke -temperatur var 6 ◦C. Vi kvantificerede analytterne ved anvendelse af analytten til standardt spidsområdet på en Agilent 1100 højtydende fluorescensdetektor G1321A og Agilent 1100-serie UV-synlige detektorer G1314A. Detektorindstillinger var λex 260 nm/λem288nm for p-cresylsulfat og λex 280 nm/λem 390nm for indoxylsulfat, indol-3-eddikesyre og intern standard. Hippursyre blev overvåget af UV-VIS-detektor ved 254 nm. Kvantitative resultater opnås og beregnes med hensyn til deres koncentrationer (Mg/L).

Fækale mikrobiota -profilprøvekollektion Kvalificerede afføringsprøver er selvindsamlet i sterile frosne rør efter forsøgspersoner og blev straks transporteret til laboratoriet, hvor de blev opbevaret ved - 80 ◦C for yderligere test.

DNA -ekstraktion og sekventering af genomisk DNA fra fækale prøver ekstraheres ved anvendelse af Qiagen DNA -afføring hurtigt kit (Qiagen) i henhold til producentens retningslinjer. Kvaliteten af ​​det ekstraherede metagenomiske DNA vurderes gennem 1,0% agarosegelelektroforese og spektrofotometrisk analyse (måling af den optiske densitet ved et forhold på 260/280 nm). For at det ekstraherede DNA skal betragtes som passende, skal koncentrationen overstige 20 ng/μl med et 260/280 nm forhold inden for området 1,8 til 2,0. Den variable region 4 (V4) af bakterielle 16S rRNA -genet amplificeres gennem polymerasekædereaktion (PCR) med bakterielle/archaeal primere 515F/806R, inklusive stregkoder til prøveidentifikation [20]. De resulterende amplikoner renses ved hjælp af genjetgelekstraktionssættet (Thermo Scientific) og kvantificeres med et qubit dsDNA HS Assay Kit på et qubit 2,0 fluorometer (QBIT). Sekventeringsbiblioteker tilberedes ved hjælp af NEBNEXT® Ultra ™ DNA Library Prep Kit til Illumina (NEB) efter producentens protokol. De oprensede biblioteker kvantificeres, normaliseres, samles og bruges derefter til klyngenerering og sekventering på en Illumina HiSeq 2500-platform til at producere 250 bp parrede læsninger.

Parret ende læses fusioneres ved hjælp af Flash v1.2.7 [21], og kvalitetsfiltrering udføres ved hjælp af Qiime 1,7-rørledningen med Python-scripts [22]. Kimære sekvenser blev fjernet af Uchime [23]. De behandlede læsninger (effektive tags) er samlet i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) ved 97% sekvensidentitet ved hjælp af UPARSE [24], og taksonomisk klassificering tildeles baseret på Silva -databasen [25]. For at vurdere de fylogenetiske forhold mellem forskellige OTU'er udføres multiple sekvensjusteringer under anvendelse af Pynast v1.2 [26] mod Silva -databasen, og et fylogenetisk træ blev konstrueret under anvendelse af FastTree [27].

Alfa -mangfoldighed estimeres af artsrigdom ved hjælp af CHAO1 -indekset på OTU -niveau. En sjældenhedskurve genereres ved tilfældigt at vælge en undergruppe af sekventeringsdata fra hver prøve for at repræsentere antallet af observerede arter, og en artsakkumuleringskurve er afbildet for at vise forekomsten af ​​nye OTU'er (arter) med kontinuerlig prøveudtagning. For beta-mangfoldighed beregnes og analyseres Bray-Curtis på OTU-niveau ved hjælp af den veganske pakke [28]. Hovedkoordinatanalyse (PCOA) udføres baseret på Bray-Curtis-afstande, og både vægtede og uvægtede UNIFRAC-parametre [29] beregnes gennem Qiime-rørledningen. Ikke-metrisk dimensionel skalering (NMD'er) udføres ved hjælp af den vægtede korrelationsnetværksanalyse (WGCNA), STAT og GGPLOT2-pakker i R ved at omdanne en afstandsmatrix af vægtede og uvægtede unifrac-parametre til et nyt sæt ortogonale akser. Alle analyser udføres ved hjælp af interne R-scripts, medmindre andet er angivet.

Funktionel sammensætning af metagenomer forudsiges fra 16S rRNA -data ved hjælp af Picrust -softwaren med Python -scripts [30]. En forudgående tabel med genkopiantal for hver genfamilie fra sekventerede bakterielle og archaeal genomer, der er baseret på IMG -databasen [32], sammen med et fylogenetisk træ fra GreenGenes -databasen [32], bruges til genindholdsforudsigelse.