Asociación entre la composición fecal de microbiota, las concentraciones de metabolitos y los niveles de sulfato de indoxilo

Pacientes y diseño de estudio

Se inscribirán sesenta pacientes con HD, de la unidad de diálisis, división renal del Hospital Taichung Metroharbour de Tungs. El consentimiento informado por escrito para participar en el estudio se obtiene de cada participante después de ser informado sobre el diseño del estudio y los objetivos. El protocolo experimental enviará a los comités éticos de IRB para su aprobación. Los criterios de inclusión son de entre 18 y 80 años y se diagnostican con Etapa V de ERC (que actualmente recibe tratamiento de hemodiálisis> 3 meses). Los criterios de exclusión incluyen mujeres embarazadas o lactantes; pacientes con trasplante de riñón, infecciones graves, enfermedades cardíacas graves y enfermedades hepáticas, malignidad, trastornos autoinmunes, desnutrición severa; consumió cualquier tipo de probióticos preorados o tenía terapia con antibióticos dentro del comienzo del estudio; Síndrome del intestino irritable diagnosticado, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa; recibir o haber recibido radiación intestinal o haber tenido resección intestinal grande, los participantes recibirán instrucciones dietéticas y se les alienta a mantener la ingesta dietética estable, que se cuantifica por cuestionarios nutricionales durante las entrevistas del paciente. Los cuestionarios reunieron información sobre la cantidad semanal y la frecuencia del consumo de alimentos y bebidas. Los datos sobre la composición de nutrientes de los diferentes alimentos se obtienen utilizando las tablas del Instituto de Nutrición y Seguridad Alimentaria, Universidad Nacional de Taiwán.

Las muestras de sangre de recolección, preparación y análisis de muestras se recolectan por separado de cada participante. Las muestras de sangre se recogen después de un período de ayuno de 8 a 12 horas, utilizando tubos de fluoruro de sodio y se mantienen en hielo hasta la transferencia al laboratorio de investigación. Una vez allí, las muestras se centrifugan a 3.000 × g durante 15 minutos a 4 ° C. El suero se transfiere a tubos estériles y se almacena a -20 ° C para un análisis futuro.

Medimos los niveles séricos de acetato, propionato, butirato y valerato, junto con SCFA de cadena ramificada como el isobutirato y el isovalerado. Estos perfiles de metabolitos se analizan utilizando espectrometría de cromatografía líquida de ultraperformancia (UPLC-MS). En resumen, se mezcla 100 μl de cada muestra de suero en microtubos de 1,5 ml con 20 mg de NaCl, 10 mg de ácido cítrico, 20 μl de HCl 1 M y 100 μl de butanol. La mezcla se agita durante 2 minutos y luego se centrifugó a 18,000 × g durante 15 minutos. El sobrenadante resultante se transfiere a microtubos frescos para su análisis.

Medición de toxinas urémicas Medimos los niveles totales de toxina urémica en lugar de los niveles libres. Las concentraciones de indoxil sulfato total, sulfato de p-cresil, ácido indol-3-acético (IAA) y ácido hippúrico se cuantifican centralmente utilizando un método descrito previamente [19]. Brevemente, para la competencia de unión, el suero de 200 μl al que agregamos 20 ácido de 0.50 mm 1-naftalenesulfónico (estándar interno) se mezclaron con 250 μl de octanoato de sodio 0.24M (competidor de unión). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, agregamos 2 ml de acetona en frío a las proteínas precipitadas. Después de la mezcla de vórtice y la centrifugación a 4 ° C, 1860 × g durante 20 minutos, el sobrenadante se transfirió a 12 mm × 100 mm, tubos de prueba de vidrio GL 14 y 2 ml de diclorometano. Después de la mezcla de vórtice y la centrifugación a 4 ° C, 1860 × g durante 10 minutos, se transfirieron 200 μl de la capa superior a los viales de muestreador de vidrio, seguido de la adición de 20 μl de HCl 1M y 15 μl en el HPLC. El análisis de HPLC se realizó en una serie Agilent 1100 LC (Santa Clara, CA), y el software Agilent Chemstations se usó para el análisis cromatográfico. La separación se llevó a cabo en una columna Zorbax SB-C18 SOLVA Saver más HPLC (5 μm, 3.0 mm × 150 mm). A una velocidad de flujo de 0.6 ml/min. La fase móvil A es ácido trifluoroacético al 0.2% en agua Milli-Q y la fase móvil B es 0.2% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. El método analítico consiste en una ejecución isocrática con 92% de fase móvil A durante 23 minutos. Cada ejecución analítica fue seguida por un gradiente de lavado de 1.3 minutos al 100% B. La temperatura de la columna fue de 25 ° C, y la temperatura de la bandeja de muestreo automático fue de 6 ° C. Cuantificamos los analitos utilizando la relación de área de analito a pico estándar en un detector de fluorescencia de alto rendimiento Agilent 1100 G1321A y detectores UV-visibles de la serie Agilent 1100 G1314A. La configuración del detector fue λex 260 nm/λem288 nm para sulfato de p-cresil y λex 280 nm/λem 390 nm para indoxilo sulfato, ácido indol-3-acético y estándar interno. El ácido hippúrico fue monitoreado por un detector UV-VIS a 254 nm. Los resultados cuantitativos se obtienen y calculan en términos de sus concentraciones (Mg/L).

La recolección de muestras de perfil de microbiota fecal muestras de heces calificadas se autocolectan en tubos congelados estériles por los sujetos y fueron transportadas inmediatamente al laboratorio donde se almacenaron a - 80 ° C para pruebas adicionales.

La extracción de ADN y la secuenciación del ADN genómico de muestras fecales se extraen utilizando el kit rápido de las heces de ADN Qiagen (Qiagen) de acuerdo con las pautas del fabricante. La calidad del ADN metagenómico extraído se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,0% y análisis espectrofotométrico (midiendo la densidad óptica en una relación de 260/280 nm). Para que el ADN extraído se considere adecuado, la concentración debe exceder los 20 ng/μl, con una relación 260/280 nm dentro del rango de 1.8 a 2.0. La región variable 4 (V4) del gen bacteriano 16S rRNA se amplifica a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores bacterianos/arqueales 515F/806R, incluidos los códigos de barras para la identificación de la muestra [20]. Los amplicones resultantes se purifican utilizando el kit de extracción de gel GeneJet (Thermo Scientific) y se cuantifican con un kit de ensayo QBIT DSDNA HS en un fluorómetro Qbit 2.0 (qubit). Las bibliotecas de secuenciación se preparan utilizando el kit de preparación de la biblioteca de ADN NebNext® Ultra ™ para Illumina (NEB), siguiendo el protocolo del fabricante. Las bibliotecas purificadas se cuantifican, normalizan, agrupan y luego se usan para la generación de clúster y la secuenciación en una plataforma Illumina HISEQ 2500 para producir lecturas de extremo emparejado de 250 pb.

Las lecturas de extremo emparejado se fusionan usando Flash V1.2.7 [21], y el filtrado de calidad se realiza utilizando la tubería QIIME 1.7 con scripts de Python [22]. Las secuencias quiméricas fueron eliminadas por Uchime [23]. Las lecturas procesadas (etiquetas efectivas) se agrupan en unidades taxonómicas operativas (OTU) al 97% de identidad de secuencia usando UPARSE [24], y la clasificación taxonómica se asigna en función de la base de datos Silva [25]. Para evaluar las relaciones filogenéticas de diferentes OTU, se realizan alineaciones de secuencia múltiple usando Pynast V1.2 [26] contra la base de datos Silva, y se construyó un árbol filogenético usando FastTree [27].

La diversidad alfa se estima por la riqueza de especies utilizando el índice Chao1 a nivel OTU. Se genera una curva de rarefacción seleccionando aleatoriamente un subconjunto de datos de secuenciación de cada muestra para representar el número de especies observadas, y se traza una curva de acumulación de especies para mostrar la aparición de nuevas OTU (especies) con muestreo continuo. Para la diversidad beta, las diferencias de Bray-Curtis a nivel OTU se calculan y analizan utilizando el paquete vegano [28]. El análisis de coordenadas principales (PCOA) se realiza en función de las distancias de Bray-Curtis, y los parámetros UNFRAC ponderados y no ponderados [29] se calculan a través de la tubería QIIME. La escala dimensional no métrica (NMDS) se realiza utilizando el análisis de la red de correlación ponderado (WGCNA), STAT y los paquetes GGPLOT2 en R transformando una matriz de distancia de parámetros UNFRAC ponderados y no ponderados en un nuevo conjunto de ejes ortogonales. Todos los análisis se realizan utilizando scripts R internos, a menos que se especifique lo contrario.

La composición funcional de los metagenomas se predice a partir de datos de 16S rRNA utilizando el software PicRust con scripts de Python [30]. Una tabla precomputada de números de copias de genes para cada familia de genes de genomas bacterianos y arqueales secuenciados, basado en la base de datos IMG [32], junto con un árbol filogenético de la base de datos GreenGenes [32], se usa para la predicción del contenido de genes.