Associatie tussen fecale microbiota -samenstelling, metabolietconcentraties en indoxylsulfaatniveaus

Patiënten en studieontwerp

Zestig HD -patiënten zullen worden ingeschreven, van Dialysis Unit, Renal Division of the Tungs 'Taichung Metroharbour Hospital van Tungs. De schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan het onderzoek wordt verkregen van elke deelnemer nadat hij is geïnformeerd over onderzoeksontwerp en -doelen. Het experimentele protocol zal ter goedkeuring naar de ethische commissies van IRB worden gestuurd. Inclusiecriteria zijn 18-80 jaar oud en gediagnosticeerd met CKD-stadium V (momenteel een hemodialysebehandeling> 3 maanden ontvangen). Uitsluitingscriteria omvatten zwangere of verpleegkundige vrouwen; Patiënten met niertransplantatie, ernstige infecties, ernstige hartziekten en leverziekten, maligniteit, auto -immuunaandoeningen, ernstige ondervoeding; verbruikt elk type pre-of probiotica of had antibioticatherapie binnen 1 maand na het begin van de studie; gediagnosticeerd prikkelbare darmsyndroom, de ziekte van Crohn of colitis ulcerosa; Het ontvangen of hebben ontvangen van darmstraling of een grote darmresectie hebben gehad De deelnemers krijgen dieetinstructies en worden aangemoedigd om een ​​stabiele inname van de voeding te handhaven, die wordt gekwantificeerd door voedingsvragenlijsten tijdens interviews met patiënten. De vragenlijsten verzamelden informatie over de wekelijkse hoeveelheid en frequentie van voedsel- en drinkconsumptie. Gegevens over de voedingssamenstelling van het verschillende voedsel worden verkregen met behulp van de tabellen van het Institute of Nutrition and Food Safety, National Taiwan University.

Monsterverzameling, voorbereiding en analyse bloedmonsters worden afzonderlijk van elke deelnemer verzameld. Bloedmonsters worden verzameld na een vastenperiode van 8 tot 12 uur, met behulp van natriumfluoridebuizen en op ijs gehouden totdat ze naar het onderzoekslaboratorium worden overgedragen. Eenmaal daar worden de monsters 15 minuten bij 4 ° C bij 3000 x g gecentrifugeerd. Het serum wordt vervolgens overgebracht naar steriele buizen en opgeslagen bij -20 ° C voor toekomstige analyse.

We meten serumspiegels van acetaat, propionaat, butyraat en valeraat, samen met vertakte keten SCFA's zoals isobutyraat en isovalerate. Deze metabolietprofielen worden geanalyseerd met behulp van ultraperformance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS). In het kort, 100 ul van elk serummonster wordt gemengd in 1,5 ml microtubes met 20 mg NaCl, 10 mg citroenzuur, 20 ul 1 m HCl en 100 ul butanol. Het mengsel wordt 2 minuten gewerveld en vervolgens 15 minuten gecentrifugeerd bij 18.000 x g. Het resulterende supernatant wordt overgebracht naar verse microtubes voor analyse.

Meting van uremische toxines meten we totale uremische toxinesniveaus in plaats van vrije niveaus. De concentraties van totaal indoxylsulfaat, p-cresylsulfaat, indool-3-azijnzuur (IAA) en hippuurzuur worden centraal gekwantificeerd met behulp van een eerder beschreven methode [19]. In het kort, voor bindende concurrentie, 200μl serum waaraan we 20 μl 0,50 mm 1-naftalenulfonzuur (interne standaard) hebben toegevoegd, werd gewalderend met 250 μl 0,24 m natriumoctanoaat (bindende concurrent). Na incubatie bij kamertemperatuur voor 5min, hebben we 2 ml koud aceton toegevoegd aan het neerhalen van proteïnen. Na het mixen van de vortex en het centrifugeren bij 4 ° C, 1860 x g gedurende 20 minuten, werd het supernatant overgebracht naar 12 mm x 100 mm, GL 14 glazen testbuizen en 2 ml dichloormethaan toegevoegd. Na vortex-mixen en centrifugeren bij 4 ° C, 1860 x g gedurende 10 minuten, werd 200μl van de bovenste laag overgebracht naar glazen autosampler flesjes, gevolgd door toevoeging van 20 μl 1 m HCl en 15 μl werd geïnjecteerd op de HPLC. De HPLC -analyse werd uitgevoerd op een Agilent 1100 -serie LC (Santa Clara, CA), en Software Agilent Chemstations werden gebruikt voor de chromatografische analyse. De scheiding werd uitgevoerd op een Zorbax SB-C18 Solv Saver plus HPLC-kolom (5 μm, 3,0 mm x 150 mm). Met een stroomsnelheid van 0,6 ml/min. Mobiele fase A is 0,2% trifluorazijnzuur in Milli-Q water en mobiele fase B is 0,2% trifluorazijnzuur in acetonitril. De analytische methode bestaat uit een isocratische run met 92% mobiele fase A gedurende 23 minuten. Elke analytische run werd gevolgd door een uitspoeling van 1,3 minuten tot 100% B. Kolomtemperatuur was 25 ° C en de autosampler -lade -temperatuur was 6 ° C. We kwantificeerden de analyten met behulp van de analyt tot standaard piekoppervlakverhouding op een Agilent 1100 hoge prestaties fluorescentiedetector G1321A en Agilent 1100-serie UV-zichtbare detectoren G1314A. Detectorinstellingen waren λex 260 nm/λEM288Nm voor p-cresylsulfaat en λex 280 nm/λEM 390 Nm voor indoxylsulfaat, indol-3-azijnzuur en interne standaard. Hippuurzuur werd gevolgd door UV-Vis-detector bij 254 nm. Kwantitatieve resultaten worden verkregen en berekend in termen van hun concentraties (mg/l).

Fecale microbiota -profielmonsterverzameling gekwalificeerde ontlasting monsters worden zelf verzameld in steriele bevroren buizen door proefpersonen en werden onmiddellijk getransporteerd naar het laboratorium waar ze werden bewaard op - 80 ° C voor verder testen.

DNA -extractie en sequencing genomisch DNA uit fecale monsters worden geëxtraheerd met behulp van de Qiagen DNA -ontlasting snelle kit (Qiagen) volgens de richtlijnen van de fabrikant. De kwaliteit van het geëxtraheerde metagenomische DNA wordt beoordeeld door 1,0% agarosegelelektroforese en spectrofotometrische analyse (het meten van de optische dichtheid bij een ratio van 260/280 nm). Om het geëxtraheerde DNA als geschikt te beschouwen, moet de concentratie 20 ng/μl overschrijden, met een verhouding van 260/280 nm binnen het bereik van 1,8 tot 2,0. Het variabele gebied 4 (v4) van het bacteriële 16S rRNA -gen wordt geamplificeerd door polymerasekettingreactie (PCR) met bacteriële/archaeale primers 515F/806R, inclusief barcodes voor monsteridentificatie [20]. De resulterende amplicons worden gezuiverd met behulp van de Genejet -gelextractiekit (Thermo Scientific) en gekwantificeerd met een qubit dsDNA HS -testkit op een qubit 2.0 fluorometer (qubit). Sequencing -bibliotheken worden bereid met behulp van de NEBNEXT® Ultra ™ DNA -bibliotheekvoorbereidingskit voor Illumina (NEB), volgens het protocol van de fabrikant. De gezuiverde bibliotheken worden gekwantificeerd, genormaliseerd, samengevoegd en vervolgens gebruiken voor clustergeneratie en sequencing op een Illumina HiSeq 2500-platform om 250 bp gepaarde lezingen te produceren.

Paired-end reads worden samengevoegd met Flash V1.2.7 [21] en kwaliteitsfiltering wordt uitgevoerd met behulp van de Qiime 1.7-pijplijn met Python-scripts [22]. Chimere sequenties werden verwijderd door Uchime [23]. De verwerkte lezingen (effectieve tags) zijn geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) bij 97% sequentie -identiteit met behulp van uparse [24], en taxonomische classificatie wordt toegewezen op basis van de SilvA -database [25]. Om de fylogenetische relaties van verschillende OTU's te beoordelen, worden meerdere sequentie -uitlijningen uitgevoerd met behulp van Pynast V1.2 [26] tegen de SilvA -database en een fylogenetische boom werd geconstrueerd met behulp van FastTree [27].

Alpha -diversiteit wordt geschat door soortenrijkdom met behulp van de CHAO1 -index op OTU -niveau. Een rarefactionele curve wordt gegenereerd door willekeurig een subset van sequentiegegevens uit elk monster te selecteren om het aantal waargenomen soorten weer te geven, en een soortaccumulatiecurve is uitgezet om het optreden van nieuwe OTU's (soorten) met continue bemonstering aan te tonen. Voor bèta-diversiteit worden Bray-Curtis-verschillen op OTU-niveau berekend en geanalyseerd met behulp van het veganistische pakket [28]. De belangrijkste coördinaatanalyse (PCOA) wordt uitgevoerd op basis van bray-curtis-afstanden, en zowel gewogen als ongewogen UNIFRAC-parameters [29] worden berekend via de Qiime-pijplijn. Niet-metrische dimensionale schaalverdeling (NMDS) wordt uitgevoerd met behulp van de gewogen correlatienetwerkanalyse (WGCNA), STAT en GGPLOT2-pakketten in R door een afstandsmatrix van gewogen en ongewogen UNIFRAC-parameters te transformeren in een nieuwe set orthogonale assen. Alle analyses worden uitgevoerd met behulp van interne R-scripts, tenzij anders aangegeven.

Functionele samenstelling van metagenomen wordt voorspeld uit 16S rRNA -gegevens met behulp van de Picrust -software met Python -scripts [30]. Een vooraf berekende tabel van genkopie -getallen voor elke genfamilie uit opeenvolgende bacteriële en archaeale genomen, gebaseerd op de IMG -database [32], samen met een fylogenetische boom uit de Greengenes -database [32], wordt gebruikt voor de voorspelling van geninhoud.