대변 ​​미생물 조성, 대사 산물 농도 및 인톡 실 설페이트 수준 사이의 연관성

환자와 연구 설계

Tungs 'Taichung Metroharbour Hospital의 신장 부서에서 Dialysis Unit에서 60 명의 HD 환자가 등록됩니다. 연구에 참여하기위한 서면 동의는 연구 설계 및 목표에 대한 정보를받은 후 각 참가자로부터 얻습니다. 실험 프로토콜은 승인을 위해 IRB의 윤리위원회에 보낼 것입니다. 포함 기준은 18-80 세이며 CKD 단계 V (현재 혈액 투석 치료> 3 개월)로 진단됩니다. 제외 기준에는 임산부 또는 간호 여성이 포함되었습니다. 신장 이식, 중증 감염, 심한 심장 질환 및 간 질환, 악성,자가 면역 장애, 심각한 영양 실조가있는 환자; 연구 시작 후 1 개월 이내에 모든 유형의 전 프로 바이오 틱스를 소비하거나 항생제 요법을 받았습니다. 과민성 대장 증후군, 크론 병 또는 궤양 성 대장염 진단; 배 방사선을 받거나 대량 장 절제술을받은 참가자들은식이 지시를 받고 안정적인식이 섭취를 유지하는 것이 좋습니다.이 섭취량은 환자 인터뷰 중에 영양 설문지에 의해 정량화됩니다. 설문지는 음식 및 음료 소비의 주간 금액과 빈도에 대한 정보를 수집했습니다. 다양한 식품의 영양분 조성에 관한 데이터는 국립 대만 대학교 영양 및 식품 안전 연구소의 표를 사용하여 얻습니다.

샘플 수집, 준비 및 분석 혈액 샘플은 각 참가자와 별도로 수집됩니다. 혈액 샘플은 불소 튜브를 사용하여 8 ~ 12 시간 금식 기간 후에 수집되고 연구 실험실로 전달 될 때까지 얼음 위에 보관됩니다. 일단 거기에, 샘플을 4 ℃에서 15 분 동안 3,000 × g에서 원심 분리한다. 이어서, 혈청을 멸균 튜브로 옮기고 향후 분석을 위해 -20 ℃에서 보관한다.

우리는 이소 부티레이트 및 이소 량과 같은 분지 체인 SCFA와 함께 아세테이트, 프로 피오 네이트, 부티레이트 및 밸리 레이트의 혈청 수준을 측정합니다. 이들 대사 산물 프로파일은 UPLC-MS (Ultraperformance 액체 크로마토 그래피-질량 분석법)를 사용하여 분석된다. 간단히 말해서, 100 μl의 각 혈청 샘플을 20 mg의 NaCl, 10 mg의 구연산, 20 μl의 1 m HCl 및 100 μl의 부탄올과 1.5-ml 마이크로 튜브에서 혼합된다. 혼합물을 2 분 동안 볼 텍싱 한 다음 18,000 × g에서 15 분 동안 원심 분리 하였다. 생성 된 상청액은 분석을 위해 새로운 마이크로 튜브로 전달된다.

요도 독소의 측정 우리는 자유 수준이 아닌 총 요혈 독소 수준을 측정합니다. 총 인톡 실 설페이트, P- 크레 실 설페이트, 인돌 -3- 아세트산 (IAA) 및 히포르산의 농도는 이전에 설명 된 방법을 사용하여 중앙에 정량화된다 [19]. 간단히 말해서, 결합 경쟁의 경우, 20μl 0.50mm 1- 나프 랄레 설 폰산 (내부 표준)을 첨가 한 200μL 혈청을 250μl 0.24m 나트륨 옥타노이트 (결합 경쟁자)로 와류 혼합 하였다. 소용돌이 혼합 및 4 ℃, 1860 × g에서 20 분 동안 원심 분리 한 후, 상청액을 12mm × 100mm, GL 14 유리 시험관으로 옮기고 2ml 디클로로 메탄을 첨가 하였다. 소용돌이 혼합 및 4 ℃에서 1860 × g에서 10 분 동안 원심 분리 한 후, 200μL의 상부 층을 유리 자동 샘플러 바이알로 옮긴 다음 20μL 1M HCl을 첨가하고 15μL를 HPLC에 주입 하였다. HPLC 분석은 Agilent 1100 시리즈 LC (Santa Clara, CA)에서 수행되었고, Agilent Chemstations 소프트웨어를 크로마토 그래피 분석에 사용 하였다. 분리는 Zorbax SB-C18 Solv Saver Plus HPLC 컬럼 (5 μm, 3.0 mm × 150 mm)에서 수행되었다. 이동상 A는 Milli-Q 수중에서 0.2% 트리 플루오로 아세트산이고 이동 상 B는 아세토 니트릴에서 0.2% 트리 플루오로 아세트산이다. 분석 방법은 23 분 동안 92% 이동상 A를 갖는 이소 크라틱 런으로 구성됩니다. 각각의 분석 실행에 이어 100% B 로의 1.3 분 세척 구배가 이어졌다. 열 온도는 25 ℃ 였고, 오토 샘플러 트레이 온도는 6 ℃였다. 우리는 Agilent 1100 고성능 형광 검출기 G1321A 및 Agilent 1100 시리즈 UV- 가시성 검출기 G1314a에서 분석 물 대 표준 피크 면적 비율을 사용하여 분석 물을 정량화했습니다. 검출기 설정은 P- 크레 실 설페이트의 경우 λEX 260 nm/λEM288NM 및 인 독실 설페이트, 인돌 -3- 아세트산 및 내부 표준의 경우 λEX 280 nm/λEM 390NM이었다. 히 푸르 산은 254 nm에서 UV-VIS 검출기에 의해 모니터링되었다. 양적 결과는 농도 (mg/L) 측면에서 얻어지고 계산됩니다.

대변 ​​미생물 총 프로파일 샘플 수집 자격을 갖춘 대변 샘플은 대상체에 의해 멸균 냉동 튜브에 자체 수집되어 있으며 추가 테스트를 위해 -80 ℃에서 보관 된 실험실로 즉시 운송되었습니다.

대변 ​​샘플로부터의 DNA 추출 및 시퀀싱 게놈 DNA는 제조업체의 지침에 따라 Qiagen DNA Stool Fast Kit (Qiagen)를 사용하여 추출된다. 추출 된 metagenomic DNA의 품질은 1.0% 아가 로스 겔 전기 영동 및 분광 광도 분석을 통해 평가된다 (260/280 nm 비율로 광학 밀도 측정). 추출 된 DNA가 적합한 것으로 간주 되려면, 농도는 1.8 내지 2.0의 범위 내에서 260/280 nm 비율로 20 ng/μL를 초과해야한다. 박테리아 16S rRNA 유전자의 가변 영역 4 (v4)는 샘플 식별을위한 바코드를 포함하여 박테리아/고풍 프라이머 515F/806R과의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭된다 [20]. 생성 된 앰플 리콘은 Genejet 겔 추출 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 정제하고 큐 비트 2.0 불소 계수 (Qubit)의 Qubit DSDNA HS 분석 키트로 정량화된다. 시퀀싱 라이브러리는 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina (NEB) 용 Nebnext® Ultra ™ DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 준비됩니다. 정제 된 라이브러리는 정량화, 정규화, 풀링 된 다음 Illumina HESEQ 2500 플랫폼에서 클러스터 생성 및 시퀀싱에 사용하여 250 bp 쌍 엔드 리드를 생산합니다.

페어링 엔드 리드는 Flash V1.2.7 [21]을 사용하여 병합되며 품질 필터링은 Python 스크립트가있는 Qiime 1.7 파이프 라인을 사용하여 수행됩니다 [22]. 키메라 서열은 Uchime에 의해 제거되었다 [23]. 처리 된 판독 (유효 태그)은 Uparse [24]를 사용하여 97% 서열 아이덴티티에서 OTU (Operational Dexonomic Unit)로 클러스터링되며 Silva 데이터베이스 [25]에 기초하여 분류 학적 분류가 할당됩니다. 상이한 OTU의 계통 발생 학적 관계를 평가하기 위해 Silva 데이터베이스에 대한 Pynast v1.2 [26]를 사용하여 다중 서열 정렬을 수행하고, Pasttree [27]를 사용하여 계통 발생 트리를 구성 하였다.

알파 다양성은 OTU 수준에서 Chao1 지수를 사용하여 종 풍부도에 의해 추정됩니다. 관찰 된 종의 수를 나타내기 위해 각 샘플에서 서열화 데이터의 서브 세트를 무작위로 선택함으로써 희귀 값 곡선이 생성되고, 종 축적 곡선은 연속 샘플링으로 새로운 OTU (종)의 발생을 보여주기 위해 플롯된다. 베타 다양성의 경우, OTU 수준에서의 Bray-Curtis 비 유사성은 비건 채식 패키지를 사용하여 계산되고 분석됩니다 [28]. 주요 좌표 분석 (PCOA)은 Bray-Curtis 거리를 기반으로 수행되며 가중 및 비가 중 Unifrac 매개 변수 [29]는 모두 Qiime 파이프 라인을 통해 계산됩니다. 비 금수 차원 스케일링 (NMD)은 가중치 및 비가 중 Unifrac 파라미터의 거리 매트릭스를 새로운 직교 축 세트로 변환함으로써 R의 WGCNA (Weighted Correlation Network Analysis), STAT 및 GGPLOT2 패키지를 사용하여 수행됩니다. 달리 지정되지 않는 한 모든 분석은 사내 R 스크립트를 사용하여 수행됩니다.

메타 게놈의 기능적 조성은 Python 스크립트가있는 Picrust 소프트웨어를 사용하여 16S rRNA 데이터로부터 예측된다 [30]. IMG 데이터베이스 [32]에 기초하여 서열 분석 된 박테리아 및 고풍 게놈으로부터 각 유전자 패밀리에 대한 유전자 카피 수의 미리 계산 된 표는 Greengenes 데이터베이스 [32]의 계통 발생 트리를 유전자 함량 예측에 사용한다.