マキベリー入りグミキャンディ (MaquiGUM)

介入のための包含および除外基準 10名の運動不足のボランティアを募集します。 包含基準: 過体重または肥満のボディマス指数（BMI）（BMIが少なくとも25.0 kg/m2以上）; 非感染性慢性疾患がないこと; そして運動不足（週3回未満の30分未満の身体活動）であること。 すべての参加者は、研究全体を通じて身体活動、食事摂取、および薬物使用を維持するよう求められます。 除外基準: 血糖降下薬、抗酸化物質を含むサプリメント、およびポリフェノールの高摂取（1日あたり2 g以上）の使用; マキベリーまたはGCsのいずれかの成分に対する食物アレルギー; 妊娠中または授乳中。 本研究は、バルパライソ大学薬学部倫理委員会（CBI 014/2022）によって承認されました。

参加者の特徴 BMIを計算するために体重と身長を測定し、ウエスト周囲長と上腕三頭筋皮脂厚も測定します。 食物摂取頻度調査票（FFQ）を研究前に回収し、主にポリフェノール、カロテン、ビタミンEおよびCの摂取量を含む、食物繊維および総食事性抗酸化物質摂取量を推定します。 すべての介入は、バルパライソ大学薬学部において、有資格の担当者によって実施されました。

介入 参加者は、各訪問間に1週間のウォッシュアウト期間を設けた、3条件の被験者内急性介入を完了します: (i) ベースライン/コントロール: 150 gの白パン（利用可能炭水化物75 g）; (ii) 白パン + GM: 150 gの白パンに24 gのGM（グミ3個）を追加; (iii) 白パン + GMM: 150 gの白パンに24 gのGMM（グミ3個）を追加。 各参加者は自身の対照として機能します。 各研究日（コントロール、GM、GMM）に、試験食摂取前に空腹時ベースラインサンプル（時間0）を採取します。 訪問は別々の日に行われ、1週間間隔を空け、標準化された前試験条件下（一晩の絶食、固定された朝のスケジュール、事前に指定された食事/活動制限）で実施されます。

コントロール条件と期待バイアスの軽減 我々のコントロール条件では、グリセミックおよび抗酸化反応に対するマキなしの対照として、白パンのみの日を使用します。 介入では、同じパン負荷に24 gのグミ（3個）を追加します。 研究者は別個の「プラセボグミ」を含めません。なぜなら、本研究は客観的な白パンコントロールを中心に設計されたパイロット研究であり、感覚的に識別不可能なポリフェノールフリーのグミを作成することは困難（マキの色素/風味）だからです; GM対GMMでさえ、我々の官能試験において匂いと味が異なり、プラセボマトリックスによる盲検化は不完全である可能性が示唆されています。 期待効果を制限し、可能なバイアスを軽減するために、研究者は以下を行います: (i) 客観的エンドポイント（血糖/インスリン/GLP-1; TRAP、SOD、CAT）を使用; (ii) 標準化された前試験条件（12時間絶食; 固定時間での朝の試験; 遵守が記録された食事/活動制限）を実施; (iii) 介入間に1週間のウォッシュアウト期間を設けます。 すべての比較は、白パンコントロールに対する個人内で行われます。

血液サンプル採取手順 血液サンプルは、各介入開始時に12時間の夜間絶食後、および2時間の期間中に参加者から採取されます。 サンプルはヘパリンナトリウムチューブ（最終濃度0.1%）に採取されます。 インスリンおよびGLP-1の測定には、血液を4℃で2000×g、10分間遠心分離し、上清を-80℃で凍結します。 抗酸化状態の測定には、血漿を赤血球から4℃で1500×g、1分間の遠心分離により分離します。 血漿は直ちに-80℃で凍結し、後続の総反応性抗酸化能（TRAP）分析に使用します。一方、赤血球はウシ血清アルブミン（BSA）で洗浄し、1500×gで15分間、3回遠心分離し、毎回上清を廃棄します。 -80℃で保存する前に、赤血球をカタラーゼ（CAT、比率1:10）およびスーパーオキシドジスムターゼ（SOD、比率1:28）のために低張液で希釈し、さらなる分析に備えます。

抗酸化状態バイオマーカー 総反応性抗酸化能（TRAP） 簡単に説明すると、10 μLの上清を、事前に45℃で30分間インキュベートした150 μM 2,20-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)と10 mM 2,20-アゾビス(2-アミジノプロパン)の1:1混合物と混合します。 動力学は、サンプル添加後10、30、50秒で734 nmで測定します。 抗酸化能は、Trolox®と比較して測定されます。

総タンパク質測定 総タンパク質量化は、SODおよびCAT酵素活性を正規化するために赤血球を使用して行われます。 このために、アルブミン標準液（Thermofisher）から作成されたアルブミン曲線に基づくPierce BCAタンパク質アッセイキット（Thermofisher）を使用します。 すべてのプロトコルは製造元の指示に従って使用されます。

スーパーオキシドジスムターゼ（SOD） このアッセイは、キサンチン/キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシドラジカルによるシトクロムcの還元に基づいています。 簡単に説明すると、5 μLの均質化サンプルを、リン酸緩衝液に溶解した0.5 mMキサンチン（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）および20 μMシトクロムC（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）と混合します。 この溶液をキサンチンオキシダーゼ（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）および0.1 mM EDTA（1:40）と混合します。 酵素活性は、Rayleigh UV-2601分光光度計で550 nmで検出されます。 各サンプルは三重複で分析されます。

カタラーゼ（CAT） カタラーゼ活性は、100 μLの0.3 M H2O2（Merck、Darmstadt、Germany）を2.9 mLのリン酸緩衝液（50 mM Na2HPO4および50 mM NaH2PO4、pH 7.8）および50 μLのサンプルからなる反応混合物の240 nmでの吸光度の減少を測定することによって決定されます。 測定は、Rayleigh UV-2601分光光度計で90秒間行われます。 各サンプルは三重複で分析されます。

グルコース、インスリンおよびGLP-1 毛細血管血液サンプルは、参加者の指からグルコース試験ストリップ（One Touch II）を使用して、白パン摂取前（時間0）およびグミの有無にかかわらず摂取後（15、30、60、90、120分後）に採取されます。 インスリン濃度のための血液サンプルは、時間点0および120分で採取され、製造元の推奨に従った化学発光免疫測定法を用いて測定されます。 ヒト血漿中のGLP-1レベルは、製造元の指示に従ってGLP-1 ELISAキット（BMS2194; ThermoFisher Cientific）を使用して、0および120分で測定されます。 血漿グルコース、インスリン、およびGLP-1の120分ごとの増分曲線下面積（AUC）は、空腹時値をベースラインとして考慮した台形則を用いて計算されます。

統計分析 サンプルサイズと検出力: 本研究は、各参加者が3条件（ベースライン、GMM、GM）で自身の対照として機能し、1週間のウォッシュアウト期間を設けた、早期段階の急性被験者内介入として構想されています。 被験者内デザインの効率性を考慮して、研究者は控えめなサンプルサイズ（n = 10の完遂者）を計画しています。 感度分析は、両側対応比較でα = 0.05、検出力80%の場合、n = 10で約Cohen's dz ≈ 0.9-1.0の大きな標準化被験者内効果を検出できることを示しています。 Shapiro-Wilk検定を使用してデータの正規性を確認します。 Spearmanの順位相関を各介入条件内（GMとGMMを別々に分析）で使用し、食後グリセミック、インスリンおよびGLP-1暴露（グリセミックAUC、インスリンAUCおよびGLP-1 AUC）と、抗酸化関連変数: SOD活性、血漿TRAP（TEAC）、カタラーゼ活性、およびFFQからの食事摂取量（ビタミンC、ビタミンE、カロテン、総ポリフェノール、および食物繊維）との関連を調べます。 研究者は、Spearman係数および両側p値（n = 10）を報告します。 本研究のパイロット的、仮説生成的な性質を考慮し、分析は探索的であり、因果関係を暗示するものではありません; 多重性調整は適用されません。 多重比較は、有意水準をp値が0.05未満と仮定してKruskal-Wallis検定を使用して行われます。 すべての分析は、GraphPad Prismソフトウェアバージョン9.0で実行されます。