Мармеладные конфеты с ягодой маки (MaquiGUM)

Критерии включения и исключения для вмешательства Будет набрано десять добровольцев, ведущих малоподвижный образ жизни. Критерии включения: индекс массы тела (ИМТ), указывающий на избыточный вес или ожирение (ИМТ не менее 25,0 кг/м²); отсутствие неинфекционных хронических заболеваний; и малоподвижный образ жизни (менее 30 минут физической активности 3 раза в неделю). Все участники будут проинструктированы сохранять свой уровень физической активности, потребление пищи и приём лекарств на протяжении всего исследования. Критерии исключения: приём гипогликемических препаратов, добавок, содержащих антиоксиданты, и высокое потребление полифенолов (более 2 г в день); пищевая аллергия на ягоды маки или любой компонент жевательных конфет; беременность или лактация. Исследование было одобрено Этическим комитетом Фармацевтического факультета Университета Вальпараисо (CBI 014/2022).

Характеристики участников Будут определены вес и рост для расчёта ИМТ, а также окружность талии и толщина кожно-жировой складки трицепса. Опросники частоты потребления пищевых продуктов (FFQ) будут собраны до начала исследования для оценки потребления клетчатки и общего количества диетических антиоксидантов, в основном полифенолов, каротинов, а также витаминов E и C. Все вмешательства были проведены на Фармацевтическом факультете Университета Вальпараисо квалифицированным персоналом.

Вмешательство Участники пройдут острое вмешательство с тремя условиями в рамках одного субъекта с недельными периодами отмывки между визитами: (i) исходный уровень/контроль: 150 г белого хлеба (75 г доступных углеводов); (ii) белый хлеб + GM: 150 г белого хлеба плюс 24 г GM (3 жевательные конфеты); и (iii) белый хлеб + GMM: 150 г белого хлеба плюс 24 г GMM (3 жевательные конфеты). Каждый участник будет служить собственным контролем. В каждый день исследования (контроль, GM, GMM) базовый образец натощак (время 0) будет взят до приёма тестовой пищи. Визиты будут происходить в отдельные дни с интервалом в одну неделю при стандартизированных предтестовых условиях (ночное голодание, фиксированное утреннее расписание и предварительно определённые диетические/активностные ограничения).

Контрольное условие и снижение влияния ожиданий Наше контрольное условие будет использовать день только с белым хлебом в качестве контроля без маки для оценки гликемических и антиоксидантных ответов. Вмешательства будут добавлять 24 г жевательных конфет (3 штуки) к той же порции хлеба. Исследователи не будут включать отдельную «плацебо-конфету», поскольку исследование является пилотным, разработанным вокруг объективного контроля с белым хлебом, а создание сенсорно неотличимой жевательной конфеты без полифенолов является сложной задачей (пигменты/вкус маки); даже GM и GMM отличались запахом и вкусом в нашем сенсорном тестировании, что предполагает, что ослепление с помощью плацебо-матрицы, вероятно, будет несовершенным. Чтобы ограничить эффекты ожидания и снизить возможную систематическую ошибку, исследователи: (i) будут использовать объективные конечные точки (гликемия/инсулин/GLP-1; TRAP, SOD, CAT); (ii) обеспечат стандартизированные предтестовые условия (12-часовое голодание; утреннее тестирование в фиксированные часы; диетические/активностные ограничения с документированным соблюдением); и (iii) внедрят недельные периоды отмывки между вмешательствами. Все сравнения будут внутриличностными относительно контроля с белым хлебом.

Процедуры взятия образцов крови Образцы крови будут взяты у участников после 12-часового ночного голодания в начале каждого вмешательства и в течение 2-часового периода. Образцы будут собраны в пробирки с гепарином натрия (конечная концентрация 0,1%). Для определения инсулина и GLP-1 кровь будет центрифугирована при 2000× g в течение 10 минут при 4 °C, и супернатант будет заморожен при -80 °C. Для измерений антиоксидантного статуса плазма будет отделена от эритроцитов путём центрифугирования при 1500× g в течение 1 мин при 4 °C. Плазма будет немедленно заморожена при -80 °C для последующего анализа общей реактивной антиоксидантной способности (TRAP), в то время как эритроциты будут промыты бычьим сывороточным альбумином (BSA), центрифугированы 3 раза при 1500× g в течение 15 минут, с удалением супернатанта каждый раз. Перед хранением при -80°C эритроциты будут разбавлены гипотоническим раствором для каталазы (CAT, соотношение 1:10) и супероксиддисмутазы (SOD, соотношение 1:28) для дальнейшего анализа.

Биомаркеры антиоксидантного статуса Общая реактивная антиоксидантная способность (TRAP) Вкратце, 10 мкл супернатанта будут смешаны со смесью 1:1 из 150 мкМ 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) и 10 мМ 2,2′-азо-бис(2-амидинопропан), предварительно инкубированной при 45 °C в течение 30 минут. Кинетика будет определена при 734 нм через 10, 30 и 50 секунд после добавления образца. Антиоксидантная способность будет измерена в сравнении с Trolox®.

Измерение общего белка Количественное определение общего белка будет выполнено с использованием эритроцитов для нормализации ферментативной активности SOD и CAT. Для этого будет использован набор Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermofisher), основанный на кривой альбумина, созданной из стандарта альбумина (Thermofisher). Все протоколы будут использованы в соответствии с инструкциями производителя.

Супероксиддисмутаза (SOD) Этот анализ основан на восстановлении цитохрома c супероксидным радикалом в системе ксантин/ксантиноксидаза. Вкратце, 5 мкл гомогенизированных образцов будут смешаны с 0,5 мМ ксантином (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 20 мкМ цитохромом C (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), растворёнными в фосфатном буфере. Этот раствор будет смешан с ксантиноксидазой (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 0,1 мМ ЭДТА (1:40). Ферментативная активность будет обнаружена при 550 нм на спектрофотометре Rayleigh UV-2601. Каждый образец будет проанализирован в трёх повторностях.

Каталаза (CAT) Активность каталазы будет определена путём измерения потери поглощения при 240 нм реакционной смеси, состоящей из 100 мкл 0,3 M H2O2 (Merck, Дармштадт, Германия) в 2,9 мл фосфатного буфера (50 мМ Na2HPO4 и 50 мМ NaH2PO4, pH 7,8) и 50 мкл образцов. Измерения будут выполнены в течение 90 секунд на спектрофотометре Rayleigh UV-2601. Каждый образец будет проанализирован в трёх повторностях.

Глюкоза, инсулин и GLP-1 Капиллярные образцы крови будут получены из пальца участника с использованием тест-полосок для глюкозы (One Touch II) до употребления белого хлеба (время 0) и после употребления с жевательными конфетами или без них (через 15, 30, 60, 90 и 120 минут). Образцы крови будут получены для определения концентраций инсулина в моменты времени 0 и 120 минут, которые будут измерены с помощью хемилюминесцентного иммуноанализа в соответствии с рекомендациями производителя. Уровни GLP-1 в плазме человека будут измерены в моменты 0 и 120 минут с использованием набора GLP-1 ELISA Kit (BMS2194; ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Инкрементальная площадь под кривой (AUC) для плазменной глюкозы, инсулина и GLP-1 за каждые 120 минут будет рассчитана с использованием правила трапеций, при этом значения натощак считаются базовыми.

Статистический анализ Объём выборки и мощность: Это исследование задумано как раннефазовое, острое, внутрисубъектное вмешательство, в котором каждый участник служил собственным контролем в трёх условиях (исходный уровень, GMM, GM) с недельной отмывкой. Учитывая эффективность внутрисубъектных дизайнов, исследователи планируют скромный объём выборки (n = 10 завершивших). Анализ чувствительности указывает, что для двусторонних парных сравнений с α = 0,05 и мощностью 80%, n = 10 может обнаружить большой стандартизированный внутрисубъектный эффект приблизительно Cohen's dz ≈ 0,9-1,0. Тест Шапиро-Уилка будет использован для подтверждения нормальности данных. Ранговые корреляции Спирмена будут использованы в рамках каждого условия вмешательства (анализируя GM и GMM отдельно) для изучения ассоциаций между постпрандиальным гликемическим, инсулинемическим и GLP-1 воздействием (гликемический AUC, инсулиновый AUC и GLP-1 AUC) и антиоксидантными переменными: активность SOD, плазменный TRAP (TEAC), активность каталазы и диетическое потребление из FFQ (витамин C, витамин E, каротины, общие полифенолы и клетчатка). Исследователи сообщат коэффициент Спирмена и двусторонние p-значения (n = 10). Учитывая пилотный, гипотезогенерирующий характер исследования, анализы будут разведочными и не подразумевают причинно-следственной связи; поправки на множественность не будут применяться. Множественные сравнения будут выполнены с использованием критерия Крускала-Уоллиса, считая p-значение менее 0,05 значимым. Все анализы будут выполнены с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версии 9.0.